《Separation and Purification Technology》：Optimization of three-phase partitioning for catechol oxidase purification from fresh deglet-nour date variety cultivated in southern Algeria, and characterization of its catalytic and thermal stability
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椰枣中儿茶酚氧化酶的优化纯化及特性研究。采用三相分配法首次实现该酶的单步纯化，优化条件为80%硫酸铵、1:1叔丁醇比例及pH7，获得1.94倍纯度和47.15%活性回收率。酶活性最适pH5.5、40℃，对4-甲基儿茶酚亲和力最高。热稳定性显示低温稳定，高温迅速变性，热力学参数表明失活为非自发能量依赖过程。三相分配法为水果酶纯化提供高效经济新方法。
Sara Bederina|Hicham Gouzi|Farouk Benaceur|Emna Ketata|Aref Nefar|Ali Faouzi Gargouri
阿尔及利亚拉古阿特（Laghouat）阿马尔泰利吉大学（University of Amar Telidji, UATL）生物与农业科学实验室（Laboratory of Biological and Agricultural Sciences, LSBA），邮编03000
摘要
儿茶酚氧化酶（CO）是一种多酚氧化酶，参与新鲜水果和蔬菜的酶促褐变过程，导致其营养价值和感官品质的下降。在本研究中，我们首次通过三相分离（TPP）技术从枣果实（Phoenix dactylifera L.）中一步纯化了该酶，并评估了其生化特性。通过优化实验条件，提高了酶的回收率和纯度。最佳条件为硫酸铵饱和度80%、叔丁醇与粗提物体积比1:1以及pH值为7，最终实现了1.94倍的纯度提升和47.15%的活性回收率。纯化后的酶在pH 5.5和40°C条件下表现出最高的活性，同时具有较低的过氧化物酶活性。使用儿茶酚、焦性没食子酚和4-甲基儿茶酚作为底物进行的动力学分析表明，该酶对4-甲基儿茶酚具有最高的亲和力。热稳定性实验显示，CO在低温下仍能保持一定的活性，但在高温下会迅速变性。热力学参数（ΔH°、ΔG°和ΔS°）表明，在所研究的温度范围内及实验条件下，酶的失活是一个依赖能量且非自发的过程。这些发现表明，TPP是一种有效、快速且经济的方法，可用于从枣果实中部分纯化CO，为进一步的生化表征和潜在的食品工业应用奠定了基础。
引言
多酚氧化酶（PPOs）是一类含有铜的金属蛋白，属于氧化还原酶家族，广泛存在于真核生物和原核生物中。它们具有氧合酶和脱氢酶的双重酶活性，在水果和蔬菜的酶促褐变过程中起着关键作用[30],[31]。
根据多项研究，多酚氧化酶根据底物特异性和催化活性被分为两大类型：酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），兼具甲酚氧化酶和儿茶酚氧化酶的活性；以及儿茶酚氧化酶（EC 1.10.3.1），可催化儿茶酚氧化为相应的邻醌。
漆酶（EC 1.10.3.2）也是一种含铜的氧化酶，能够氧化酚类化合物，但属于另一类多铜氧化酶，具有不同的催化机制，因此通常不归类为PPOs。
儿茶酚氧化酶（CO；EC 1.10.3.1）是一种含有两个铜核的酶，利用分子氧作为电子受体催化儿茶酚的双电子氧化反应，这一过程称为儿茶酚氧化酶活性。这类酶可将o-二羟基苯氧化为o-醌，随后o-醌会自聚形成黑色素，这是一种从棕色到黑色的色素，具有保护受损组织免受病原体侵害的作用[41],[46]。
枣树（Phoenix dactylifera L.）是最古老且经济价值较高的水果作物之一，主要种植在干旱和半干旱地区。阿尔及利亚是全球主要的枣生产国之一，尤其以其优质品种Deglet Nour而闻名[15]。除了经济和营养价值外，枣果实还是富含生物活性化合物和工业/生化研究所需酶的来源。其中，儿茶酚氧化酶在枣果的储存和运输过程中的酶促褐变中起着关键作用，影响其颜色、质地和整体品质[9]。因此，研究和提取枣果实中的儿茶酚氧化酶不仅有助于理解酶促褐变的生化机制，也有助于探索该酶在食品加工和保鲜中的潜在生物技术应用。
高效纯化酶对于准确表征其生化和催化特性以及实现其潜在的生物技术应用至关重要。传统的纯化方法（如硫酸铵沉淀、透析和色谱技术）往往耗时、成本高昂，并可能导致酶回收率低或酶失活。为克服这些限制，三相分离（TPP）技术作为一种快速、简单且高效的酶纯化方法应运而生[33],[48]。TPP结合了盐析和溶剂分配的原理，能够选择性地将蛋白质分离并富集在水相和有机相的界面层中[10]。该技术具有高纯化效率、优异的酶稳定性、可扩展性和缩短的处理时间等优点[40]。尽管三相分离技术已广泛应用于植物酶的纯化（尤其是从叶片、草本植物和其他非果实组织中提取的酶），但在果实中分离多酚氧化酶的应用仍较为有限。现有研究主要集中在茶叶、芳香植物或其他植物来源的PPOs上[1],[34],[47],[51]。据我们所知，目前尚无使用TPP技术从果实中纯化儿茶酚氧化酶的研究，这突显了我们方法的新颖性和原创性。
因此，本研究旨在通过三相分离（TPP）技术优化枣果实（Phoenix dactylifera）中儿茶酚氧化酶的提取和纯化过程。系统评估了影响TPP效率的具体参数，如硫酸铵浓度、叔丁醇与提取物体积比和pH值。纯化后的酶通过电泳方法进行了进一步分析，并进行了生化表征，以确定其催化效率、动力学常数和与热稳定性相关的热力学参数。这些全面的表征结果有助于更好地理解该酶的稳定性和功能特性，为其在食品和生物技术中的应用提供了依据。
材料
2022年10月，我们从阿尔及利亚拉古阿特的一个当地市场购买了完全成熟（Tamr阶段）、未经处理的新鲜枣果实（品种：Deglet-Noor，Phoenix dactylifera L.）。挑选样本时严格保证了颜色和生理成熟度的均匀性，并排除了有可见损伤或缺陷的果实。枣果实被储存在-10°C条件下待进一步使用。
所有使用的试剂和溶剂均为分析级。
通过三相分离纯化儿茶酚氧化酶
经过TPP处理后，儿茶酚氧化酶主要富集在界面层中，该层的体积仅占总体积的4.5 mL——相比初始提取物减少了77.5%，表明酶的浓缩效果显著。该层中的蛋白质浓度略有增加（6.67 g/L），但酶活性显著提高（10.08 IU/mL）。TPP纯化后酶活性的提升可能不仅
结论
本研究成功使用三相分离（TPP）技术从枣果实中提取并部分纯化了儿茶酚氧化酶。最佳纯化条件为硫酸铵饱和度80%、叔丁醇与粗提物体积比1:1以及pH值7，纯化倍数达到1.94倍，活性回收率为47.15%。该酶在pH 5.5和40°C条件下表现出最佳活性，其中4-甲基儿茶酚对其具有最高的底物亲和力。热稳定性实验表明，该酶在低温下具有中等稳定性
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了阿尔及利亚科学研究与技术发展总局（Algerian General Directorate of Scientific Research and Technological Development, DGRSDT）的支持。
