《Analytica Chimica Acta》：Development of a natural dihydrofolate reductase receptor binding assay for detecting the sulfonamide synergists group in foodstuff samples
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磺胺增效剂检测方法研究：比较N端与C端His标签对DHFR受体结合能力的影响，发现N端标签在直接竞争受体结合法（DCRBA）中灵敏度更高（IC50 8.82-38.53 μg/L），并成功应用于牛奶、猪肉等动物源性食品的筛查，平均回收率71.30-118.56%，变异系数<19.27%。
王晓楠|徐璐|王婉瑜|马克西姆·A·伯金（Maksim A. BURKIN）|谢尔盖·A·埃雷明（Sergei A. EREMIN）|高文杰|郭柳川|张启迪|王展辉|梁晓
青岛农业大学兽医学院，中国青岛市长城路700号，266109
摘要：
监测动物源性食品中的磺胺类增效剂（SSGs）对于确保食品安全和公共健康至关重要。基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的受体结合测定法相比抗体具有更均匀的亲和力，能够有效检测这类增效剂。该受体通常以带有His标签的融合蛋白形式表达，以便于亲和纯化并获取足够的实验材料。然而，重组DHFR上His标签的位置如何影响测定格式和分析灵敏度目前尚不清楚。在本研究中，我们评估了亲和标签位置（N端 vs C端）对受体结合能力的影响。比较了两种测定方法：直接竞争性受体结合测定（DCRBA）和间接竞争性受体结合测定（ICRBA），其中DHFR分别作为包被试剂和检测试剂。结果表明，N端标记的DHFR受体在DCRBA格式下表现更好。基于N端标记的DHFR的测定方法显示出高灵敏度和广谱特异性，对于五种主要SSGs（三甲氧嘧啶、二氨基吡啶、奥美托普林、巴基洛普林和布罗迪莫普林）的IC50值介于8.82至38.53 μg/L之间。该方法在牛奶、脱脂牛奶、鱼、猪肉和鸡肉等实际样品中得到了验证，平均回收率在71.30%-118.56%之间，变异系数低于19.27%。总体而言，我们探讨了标签位置对受体亲和力的影响以及合适的检测格式，并最终开发了一种基于N端DHFR的受体结合测定方法，用于简单、灵敏且高通量地筛查动物源性产品中的SSGs残留。
引言
磺胺类增效剂（SSGs）是一类通过抑制细菌二氢叶酸还原酶来增强磺胺类药物抗菌活性的化学分子[1][2][3]。它们在兽医实践中被广泛用于治疗和预防食品生产动物的细菌感染。SSGs的残留可能危害消费者健康（例如引起过敏反应），并促进抗菌耐药性的产生，这引发了人们对动物源性产品的严重担忧。因此，开发有效的SSGs筛查方法至关重要[4][5][6]。
传统上，SSGs的分析主要依赖于高效液相色谱（HPLC）[7][8][9]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[10][11][12]等仪器方法。尽管这些技术具有出色的灵敏度和特异性，但其应用受到昂贵设备、复杂操作和样品制备过程的限制，从而不太适合快速和大规模的筛查[12][13][14][15]。相比之下，免疫测定法（如ELISA）成本低廉、操作简单、样品预处理要求少，能够实现快速、高通量的现场筛查[16][17][18][19]。先前报道的单克隆抗体（mAb）5C4可以识别五种主要SSGs；然而，其交叉反应性范围很广（48.2%-418.7%），表明不同化合物之间的差异较大[20]。其他生物识别方法，如适配体和分子印迹聚合物，具有高稳定性和可设计性[21][22][23][24]，但在动物源性产品中的实际检测仍需进一步研究。
二氢叶酸还原酶（DHFR）是SSGs的作用靶标，由于其保守口袋能够与SSGs和DHF竞争性结合而表现出广泛的特异性[25][26][27]。尽管已有使用重组表达或工程突变体进行的受体测定方法，但亲和标签位置对受体结合能力和分析性能的影响尚未系统研究。由于His标签体积小且易于纯化，它们在融合蛋白表达系统中被广泛使用。早期研究表明，将His标签连接到ZNF191(243-368)的N端和C端会对蛋白质的性质和结构产生不同影响[28][29]。此外，虽然去除标签可以减少标签引起的干扰，但研究表明切割亲和标签会降低蛋白质活性和回收率（例如部分变性、构象扰动和非特异性损失[30]。因此，合理定位DHFR标签以保持其天然功能在原理上优于表达后的切割。
受上述发现的启发，并考虑到DHFR与SSGs的结合需要其保守活性口袋的完全暴露，我们首次评估了His6-亲和标签位置对DHFR结合能力和分析性能的影响。首先，我们通过分子对接模拟解释了DHFR如何识别SSGs。其次，分别采用直接竞争性受体结合测定（DCRBA）和间接竞争性受体结合测定（ICRBA）两种方法，其中DHFR分别作为包被试剂和检测试剂。最后，本研究开发的基于N端DHFR的结合测定方法在实际样品分析中显示出大规模筛查SSGs的巨大潜力。这项关于His6标签位置的研究为功能性生物分子的设计提供了新的见解，并为提高受体在分析测定中的性能提供了实用指导。
材料与设备
携带pET-28a-SA-DHFR质粒的E. coli BL21 (DE3)菌株及其表达的pET-28a-SA-DHFR蛋白储存在我们的实验室中。三甲氧嘧啶（TMP）、二氨基吡啶（DVD）、奥美托普林（OMP）、巴基洛普林（BQP）和布罗迪莫普林（BOP）由Ehrenstorfer博士（德国）提供。二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）和异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自北京Solarbio科技有限公司。
DHFR-SSGs相互作用的表征
SSGs是一类含有共同二氨基嘧啶核心的抗菌分子。DHFR-TMP共晶结构分析显示，该口袋由疏水性残基Ala7、Leu5、Phe92、Ile50、Val31和Leu20以及亲水性残基Asp27组成，这些残基通过氢键和疏水相互作用共同形成稳定的网络（图1C）。基于SSGs的共同结构特征，我们进行了分子对接研究
结论
酶联免疫吸附测定（ELISAs）被广泛用于检测食品基质中的有害小分子污染物，选择合适的生物识别元件对于实现高灵敏度和分析选择性至关重要。由于目前报道的单克隆抗体具有较大的交叉反应性范围，这限制了基于抗体的免疫测定法在大规模应用中的效果。在本研究中，我们使用了天然的DHFR作为
CRediT作者贡献声明
王婉瑜：验证、方法学、数据整理。马克西姆·A·伯金（Maksim A. BURKIN）：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。徐璐（Lu Xu）：撰写 – 初稿、可视化、实验研究。王展辉（Zhanhui Wang）：方法学。梁晓（Xiao Liang）：监督、项目管理、方法学、资金获取。王晓楠（Xiaonan Wang）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、验证、方法学、概念构思。谢尔盖·A·埃雷明（Sergei A. EREMIN）：数据分析、概念构思。高文杰（Wenjie Gao）：软件支持。郭柳川（Liuchuan Guo）：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性
本文研究未使用任何数据。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本项目得到了国家自然科学基金（编号：31502123）、山东省自然科学基金（编号：ZR2023QC123）以及青岛市科技项目的资助（项目编号：24-1-8-xdny-21-nsh 和 24-1-8-xdny-29-nsh）。
