人类尿液中的1H-qNMR分析：外部标准方法在绝对代谢物定量中的应用验证

《Analytical Biochemistry》：1H-qNMR analysis of human urine: Validation of an external standard approach for absolute metabolite quantitation

定量核磁共振技术用于尿液中14种代表性代谢物的绝对定量研究，通过外部标准校准方法验证了高线性（R2≥0.9987）、精度（%RSD<15%）和回收率（87%-103%），解决了复杂生物基质中的多组分定量难题。

　　

埃杜阿多·祖尔-埃尔南德斯（Eduardo Zul-Hernández）|诺埃米·瓦克斯曼-明斯基（Noemí Waksman-Minsky）|维罗妮卡·M·里瓦斯-加林多（Verónica M. Rivas-Galindo）|保拉·科尔德罗-佩雷斯（Paula Cordero-Pérez）|埃内斯托·桑切斯-门多萨（Ernesto Sánchez-Mendoza）|J·里卡多·卢西奥-古铁雷斯（J. Ricardo Lucio-Gutiérrez）|阿尔玛·L·索塞多（Alma L. Saucedo）

墨西哥新莱昂自治大学（Universidad Autónoma de Nuevo León）医学院分析化学系，蒙特雷（Monterrey），新莱昂州（Nuevo León）

摘要

定量核磁共振（qNMR）光谱技术是一种强大的代谢物分析工具，具有重复性、样品制备简单以及非破坏性测量的优点。本研究开发并验证了一种基于外部标准校准的¹H-qNMR方法，用于人体尿液中14种代表性代谢物的绝对定量分析。代谢物的选择基于它们在人类尿液代谢组中的普遍存在，并通过文献中的频率数据进行支持，从而得到了一组化学成分多样的代谢物，包括氨基酸、有机酸、碳水化合物和胺类。该方法根据EUROLAB和ENFSI的指南进行了验证，评估了其特异性、线性、精确度、准确性、灵敏度、稳健性和基质效应。实验结果表明：校准曲线具有高度线性（R² ≥ 0.9987），准确性和精确度符合接受标准（%误差 < 10%，%RSD < 15%），回收率在87%至103%之间。检测限和定量限适用于生理尿液浓度范围，除了一种分析物外，基质效应均保持在可接受的±20%范围内。稳健性测试证实了该方法在轻微变化条件下的稳定性，仅需要对芳香族共振峰的松弛延迟进行控制。将该方法应用于健康个体的尿液样本后，证实了其适用于低丰度和高丰度代谢物的定量分析。重要的是，由于包含了结构多样的代谢物，因此可以采用不同的定量策略，例如在拥挤区域进行光谱反卷积或对构象异构体进行信号叠加。总体而言，这种经过验证的方法为通过¹H-qNMR进行尿液中代谢物的绝对定量提供了一个稳健且灵活的平台，提升了基于NMR的代谢组学的可靠性，并为其在临床研究中的应用提供了支持。

引言

代谢组学是一门致力于识别和定量生物体产生的代谢物及其在各种代谢途径中作用的“组学”科学。在医学研究中，代谢组学研究主要聚焦于识别诊断和预后生物标志物，以及通过生物流体和组织分析确定疾病原因[1]。尿液是最常被分析的生物流体之一，因为它直接反映了肾功能，并能监测多种病理状态，因此对其代谢物的定量分析至关重要[2]。 在代谢组学研究中，常用的分析技术包括质谱（MS）[3]和核磁共振（NMR）光谱[4]。NMR具有多种优势：它是一种非破坏性技术，样品制备要求低，重复性高，并且可以应用多种类型的定量分析[5],[6]。其中，基于NMR的定量分析方法（qNMR）特别具有优势，其原理是信号强度与参与核的数量成正比，因此信号强度也与分析物浓度成正比。qNMR广泛用于药物、生物代谢物和天然产物的定量分析，无论是纯物质还是复杂混合物[7]。qNMR测量在受控实验条件下进行，包括温度调节、足够的热平衡时间以及恒定的采集和处理参数[8]。在各种qNMR方法中，基于质子的定量NMR（¹H-qNMR）灵敏度最高，因此在代谢组学中应用最为广泛[9]，既能进行相对定量也能进行绝对定量。相对定量是通过比较光谱中信号的摩尔浓度来实现的（100%方法），而绝对定量则独立于样品基质，使用纯度已知的校准标准来确定分析物浓度。绝对定量可以通过外部或内部校准方法进行：外部校准通过校准曲线或电子方法比较分析物与外部参考化合物的积分[10]；内部校准则是在样品中添加已知浓度的内部参考物质[11],[12]。根据EUROLAB[13]和ENFSI[14]的指南，需要对绝对定量方法进行验证，评估其特异性、线性、精确度、准确性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和稳健性。此外，还需要确认不存在基质效应[15],[16]。 在利用NMR进行尿液代谢组学研究时，大多数定量方法依赖于钠2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸盐（DSS）或2,2,3,3-四氘代-3-（三甲基硅基）丙酸（TSP）的信号强度作为内部浓度参考[17]。然而，为了使这些定量方法具有实际分析价值，需要开发经过验证的绝对定量方法，以提高其在尿液代谢组学应用中的可靠性。开发这样的方法有助于确保尿液代谢物定量分析的严谨性，并支持生物标志物或特定发现的可靠解释，以及基质效应的评估。无论是采用内部还是外部校准方法，开发用于尿液代谢物绝对定量的分析方法都是必要的，因为现有的大多数基于NMR的代谢组学方法都依赖于相对定量。因此，本研究的目的是开发并验证一种¹H NMR方法，用于健康个体尿液样本中14种代谢物的绝对定量。为此，参考了EUROLAB和ENFSI的指南来处理NMR特有的方法学问题，并应用了FDA发布的《生物分析方法验证指南》（Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry）[18]以及同行评审文献[15],[19],[20]中规定的接受标准。所验证的方法旨在为未来的代谢组学研究提供一个补充的分析工具。

试剂和体积材料

氘氧化物（D₂O，99.9% D原子，0.75% w/v TSP）、磷酸二钠二水合物（≥ 98.5%）、磷酸一钠二水合物（≥ 99.0%），以及甘氨酸、马尿酸、柠檬酸三钠二水合物、肌酐、D-葡萄糖、二甲胺-HCl、甘氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、肌酸一水合物、三甲胺N-氧化物、牛磺酸、环丝氨酸-HCl和咪唑（纯度≥ 95%）等标准品，均由Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）提供。

尿液代谢物的选择和内部标准物的确定

在初始阶段，根据人类尿液代谢组项目的数据[21]确定了92种代谢物。这些代谢物的名称及其相对浓度（以肌酐比为单位，单位为μM/mM肌酐）列在表SI3中。在第二阶段，通过文献回顾将列表缩小到27种代谢物；选定的代谢物及相关参考文献信息列在表SI4中。最终确定了14种化学成分多样的代谢物，这些代谢物具有公认的生理功能。

结论

基于外部标准校准的¹H-qNMR方法被证明是一种可靠的策略，可用于复杂生物基质中尿液代谢物的绝对定量分析。该方法表现出良好的特异性、极高的线性（R² ≥ 0.9987）、可接受的准确度（%误差 < 10%）和精确度（%RSD < 15%），以及符合接受范围的回收率（87–103%）。检测限和定量限适用于尿液代谢物的生理浓度范围。

关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写本文期间，作者使用了ChatGPT（免费版本4.0）来纠正英语语法和风格。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

作者贡献声明

维罗妮卡·里瓦斯-加林多（Verónica Rivas-Galindo）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、研究设计、概念构思。 保拉·科尔德罗-佩雷斯（Paula Cordero-Pérez）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法学设计。 埃杜阿多·祖尔-埃尔南德斯（Eduardo Zul-Hernández）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、方法学设计、数据管理。 诺埃米·瓦克斯曼-明斯基（Noemí Waksman-Minsky）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、验证工作、软件应用、研究设计、数据整理。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系： 阿尔玛·L·索塞多（Alma L. Saucedo）表示获得了国家科学技术委员会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología）和PAICYT-UANL的财政支持。

致谢

本项工作得到了CONACYT的资助，项目编号为2017-01-5652，以及PAICYT-UANL的资助，项目名称为“通过多变量统计分析确定2型糖尿病的尿液和血清生物标志物：基于RMN的代谢组学分析”（Clave: 233-CS-2022）。