综述：基于膜蛋白识别的外泌体分离方法综述：技术原理、分离效果及面临的挑战

《Analytica Chimica Acta》：A review of exosome isolation based on membrane protein recognition: Methods, performance, and challenges

外泌体作为细胞间通讯载体，其分离面临尺寸小、异质性高、产率低等挑战。传统物理方法存在操作复杂、纯度不足等局限，基于膜蛋白的靶向分离技术（如免疫磁分离、固相亲和界面）通过抗体或配体特异性捕获膜蛋白（如CD63、CD81），显著提升分离效率和特异性。综述系统评估了微流控整合、纳米材料应用等创新平台，提出多标记识别和温和释放机制为未来方向，推动外泌体在精准医疗和液体活检中的转化应用。

　　

郭明辉|黄阳|史宇飞|张慧英|徐凤华|董欣|张雪

上海大学医学院，中国上海市宝山区上大路99号，200444

摘要

背景

外泌体参与细胞间通讯、免疫调节以及肿瘤的发生和发展等生理和病理过程，在早期疾病诊断、治疗靶点识别和药物递送系统开发方面具有巨大潜力。然而，外泌体的分离面临诸多挑战：体积微小、异质性高、产量极低以及复杂的生物基质等。传统的超离心和超滤方法存在操作复杂、纯度不足和特异性差等问题。研究人员越来越关注外泌体表面特异性膜蛋白的识别能力，开发针对这些膜蛋白的分离策略以提高分离效率和特异性。

结果

本文总结了基于膜蛋白识别的外泌体分离技术的最新进展，阐述了基于亲和力的捕获原理，强调了外泌体表面蛋白与抗体、适配体和肽等识别分子之间的选择性相互作用。还介绍了免疫磁分离、固相亲和界面、微流控免疫亲和系统和基于配体的富集方法等代表性技术平台。与传统物理分离方法相比，这些策略具有更高的选择性和捕获效率。同时，文中也讨论了整合纳米材料、微流控技术和多功能平台的最新发展，这些技术能够提高分析灵敏度并实现更精确的外泌体表征。此外，还探讨了当前存在的问题，如外泌体异质性、识别分子的局限性、囊泡完整性的保持以及自动化和高通量系统的需求，并展望了开发更稳健、更具选择性和临床应用性的分离技术的前景。

意义

本文综述了基于膜蛋白的外泌体分离研究进展，分析了其优势与挑战，并为未来优化和应用外泌体分离方法提供了参考。基于膜蛋白的外泌体分离技术比传统物理方法具有更高的选择性和效率。文章提出了多标记物识别、温和释放和自动化临床平台等发展方向，以促进外泌体的临床转化。

引言

外泌体是由脂质双层膜包裹的纳米囊泡，包含外膜和内部物质[1]、[2]、[3]。外膜富含胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸等脂质，并表达四跨膜蛋白、flotillins、TSG101、ceramide、Alix、整合素以及热休克蛋白HSP70和HSP90等特异性标记蛋白[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。外泌体内部含有蛋白质、核酸、代谢物和少量脂质等生物活性物质，这些成分反映了来源细胞的特性[9]。外泌体的生物发生过程涉及多囊泡体（MVBs）的形成，MVBs通过内吞作用产生并包含多个细胞内结构。当这些MVBs与细胞膜融合时，内部的细胞内结构被释放到细胞外基质中形成外泌体[10]、[11]。这一过程受到内体分选复合体（ESCRT）和非ESCRT途径的调控[5]。在生理和病理条件下，几乎所有细胞类型都能产生外泌体，它们广泛分布于血液、唾液、母乳或尿液等易获取的体液中[12]、[13]。外泌体通过生物活性分子调节受体细胞的功能和状态，在细胞间通讯中发挥关键作用，同时在免疫反应、心血管疾病、中枢神经系统和癌症等领域具有广泛的应用前景[14]、[15]。

高纯度外泌体的分离在生物医学研究和临床应用中具有重要意义。作为液体活检中的潜在生物标志物，外泌体已被用于检测癌症、神经退行性疾病和感染性疾病的早期生物学信号[16]、[17]。高纯度外泌体是确保其作为药物递送载体有效性和安全性的关键，同时有助于减少样本中非外泌体成分的干扰，从而提高分子分析和功能研究的可靠性。然而，外泌体的分离面临诸多挑战，限制了其在高通量检测和临床应用中的应用。一方面，由于外泌体体积小、密度低，与其他细胞外囊泡和可溶性蛋白质共存导致样本复杂性增加[18]、[19]；另一方面，传统的超离心和密度梯度离心方法操作复杂、耗时较长、回收率低且纯度低[20]、[21]。近年来，先进的仿生界面技术通过模拟生物识别过程，有效克服了这些难题，实现了复杂临床样本中外泌体的高选择性捕获[22]。

通常，这些基于仿生和识别的策略利用了外泌体表面富含四跨膜蛋白家族、TSG101和Alix等特征性膜蛋白的事实。这些膜蛋白不仅作为外泌体的标志物，也是开发靶向分离策略的关键靶点[23]。与传统超离心和密度梯度离心方法相比，免疫亲和方法在分离效率和选择性方面具有明显优势[24]。微流控技术与免疫捕获方法的结合进一步提升了分离过程的效率和便捷性[25]。尽管传统物理方法在分离规模和成本控制方面有一定优势，但在分离纯度和特异性方面仍存在不足，限制了外泌体在精准医学领域的应用。为克服传统方法的局限性，研究人员开发了多种基于膜蛋白识别的靶向分离策略，利用抗体或配体实现对外泌体特异性膜蛋白的高亲和力识别，显著提高了分离效率和样本纯度。免疫磁分离、微流控平台和亲和配体等技术不断进步，具有操作简便、高通量和选择性分离等优点，特别适用于处理复杂临床样本。

本文从“基于膜蛋白的靶向识别”这一独特视角系统回顾了外泌体分离技术的最新进展。以往的综述主要列举了所有分离方法（如超离心、色谱和沉淀[26]、[27]、[28]、[29]、[30]），但往往将膜蛋白识别视为这些技术的次要或可选部分，而非实现高选择性的核心机制。相比之下，本文专注于膜蛋白靶向策略，深入探讨了实现外泌体亚群精确捕获的生化基础。本文评估了五种核心技术途径：免疫磁材料、固相界面选择、免疫微流控、亲和配体识别和集成平台，全面分析了各种平台的分析性能指标（包括捕获效率、释放/洗脱效率、结构完整性和临床适用性），批判性地分析了其在处理复杂生物基质时的优缺点。文章强调了“温和释放”机制和“多标记物识别”在保持外泌体生物完整性方面的关键作用，并为人工智能辅助的分子筛选和集成即时检测（POCT）平台提供了前瞻性蓝图。通过系统回顾和综合分析当前技术路径，本文旨在为未来分离平台的优化设计提供理论基础，促进外泌体技术在疾病诊断和精准医学中的转化应用。

节选内容

外泌体膜蛋白

外泌体膜蛋白广泛分布于外泌体的双层膜结构中，具有多样性和多种功能。深入研究的外泌体膜蛋白包括四跨膜蛋白、整合素、主要组织相容性复合体（MHC）分子和脂质筏相关蛋白[10]、[31]。根据膜定位，外泌体膜蛋白可分为跨膜蛋白等类别

基于膜蛋白的靶向外泌体分离技术

基于膜蛋白的靶向外泌体分离技术主要利用免疫亲和捕获方法，该方法利用外泌体表面的特异性标记物进行分离和纯化[54]、[55]。其核心原理是利用抗体或配体与目标分子之间的高亲和力和特异性[56]。通过将这些抗体或配体固定在载体上，可以捕获外泌体膜表面的目标分子，如CD9、CD63、CD81、CD82、CD91、CD56等[57]

总结与展望

外泌体作为细胞间通讯的关键介质，携带蛋白质、核酸、代谢物和脂质等生物活性分子，这些分子蕴含疾病特异性信息[103]、[104]。因此，它们在精准医学、液体活检和再生医学领域受到广泛关注[105]、[106]、[107]。基于膜蛋白的靶向分离技术利用其对外泌体表面特异性蛋白的高亲和力识别能力，具有重要意义

作者贡献声明

黄阳：数据可视化。郭明辉：撰写初稿。张雪：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。张慧英：数据可视化。史宇飞：数据可视化。董欣：数据分析。徐凤华：数据可视化

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性

本文研究未使用任何数据。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22304002）和上海大学医学院数字医学研究所（项目编号：SHU-UM-JBGS-2025-9）的支持。

郭明辉是上海大学医学院的研究生，她的研究主要集中在外泌体和肽的富集方面。