《Forests》：An Efficient High-Throughput Genetic Transformation Method for Hybrid Poplar
Gary Coleman,
Gen Li,
Reuben Tayengwa,
Simon Sretenovic,
Yiping Qi and
Edward Eisenstein
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本文描述了一种用于杨属杂交种（Populus tremula x alba clone 717 1B）高效高通量转化的简化方法。在开发该方法时，研究人员考虑了准备大量外植体进行转化的便捷性与效率，以及选择能够促进细胞和组织生长同时提高再生芽能力的培养基。研究发
本文描述了一种用于杨属杂交种（Populus tremula x alba clone 717 1B）高效高通量转化的简化方法。在开发该方法时，研究人员考虑了准备大量外植体进行转化的便捷性与效率，以及选择能够促进细胞和组织生长同时提高再生芽能力的培养基。研究发现，来自体外培养幼苗的叶柄外植体易于收集并准备用于转化，其再生芽的能力与茎或叶外植体相当。将叶柄外植体培养在Driver Kuniyuki Walnut（DKW）培养基上，与Murashige Skoog（MS）培养基相比，组织生长显著增加。此外，在愈伤组织诱导培养基（CIM）中添加低浓度的噻苯隆（thidiazuron, TDZ）显著提高了培养叶柄外植体的芽再生能力。因此，使用DKW培养基并在愈伤组织诱导阶段添加2.2 μg/L TDZ的叶柄外植体组合，实现了该杂交杨基因型的快速高效转化。当应用于激活标记（activation tagging）或CRISPR-Cas9和Cas12a基因编辑等基因组学方法时，转化效率在70%至90%之间。所描述的方案提供了一种简单高效的方法，易于扩展以用于高通量方法，从而促进大规模方法用于快速高效地生产转化杨属杂交种。
杨属（Populus）作为重要的速生林业树种和生物能源原料，因其生长迅速、易于繁殖且基因组序列已知，已成为树木生物学研究的重要模式系统
[1,2,3]。尽管多种杨属物种可通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导进行遗传转化，但现有方法主要依赖茎节间或叶盘外植体，其制备耗时且芽再生能力有限，难以满足高通量筛选的需求。为解决这一问题，研究人员基于叶柄富含维管组织可促进再生的假设，旨在开发一种简便、高效且易于扩展的高通量转化方法，以加速基因功能研究和优良品种培育。
研究人员采用杨属杂交种Populus tremula x alba clone 717 1-B4作为实验材料，利用体外培养的幼苗叶柄作为外植体，结合培养基成分优化，建立了农杆菌介导的高效转化体系。主要技术方法包括：筛选适合的组织培养基，比较MS培养基与Driver Kuniyuki Walnut（DKW）培养基对愈伤组织生长和芽再生的影响；在愈伤组织诱导培养基（CIM）中探究不同浓度植物生长调节剂（包括α-萘乙酸NAA、6-γ,γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤2iP、6-苄基腺嘌呤BA及噻苯隆TDZ）对芽再生潜力的调控作用；利用含报告基因、激活标记及CRISPR-Cas9/Cas12a编辑载体的农杆菌株（C58p/MP90和GV3101/pMP90RK）对叶柄进行共培养转化，并通过组织化学染色和PCR验证转化效率。
研究结果显示：首先，DKW培养基显著优于MS培养基。在20天的培养后，DKW培养基上叶柄外植体的愈伤组织和再生芽鲜重（FW）显著高于MS培养基，而叶柄是否受损对生长无显著影响（3.1节）。其次，噻苯隆（TDZ）延长了芽再生能力窗口期。在缺乏TDZ的培养基中，随培养时间延长，再生芽比例显著下降；而在添加2.2 μg/L TDZ的培养基中，即使培养3-4周，再生能力仍保持在92%-100%（3.2节）。第三，叶柄转化效率远高于茎外植体。使用激活标记载体pSK1074转化时，叶柄外植体的再生抗性芽比例达90%，而茎节间仅为35%；在大规模转化中，70%的叶柄外植体再生出抗性芽，且95%以上成功生根，PCR验证证实T-DNA整合（3.3节）。最后，该体系适用于基因编辑。利用CRISPR-Cas9和Cas12a多重编辑载体，针对NAGK、TOR、4CL1、PII和SVP等基因的转化效率极高， hygromycin抗性芽产生率分别达到98.9%、98%和89%，PCR验证确认了编辑载体的存在（3.4节）。
在讨论部分，研究人员指出，通过选用易于制备且富含维管组织的叶柄作为外植体，结合DKW培养基提供的更优宏量营养元素比例（如较低的钾、较高的硫、钙和镁）及低浓度TDZ对植物激素平衡及多能性相关转录因子（如WIND1、PLT3、CUC1/2等）表达的潜在调控作用，显著提高了再生效率。与传统茎或叶外植体相比，该方法不仅简化了操作，还将转化效率从以往的1.5%-60%提升至 routinely >75%，甚至超过90%，且适用于激活标记及CRISPR基因编辑。
结论表明，该基于叶柄和改良培养基的转化方案为杨属杂交种的遗传改良提供了有力工具。该方法减少了外植体制备的时间和人力，实现了高通量、高效率的转化，极大地促进了杨属基因功能研究和育种进程。
