综述：CRISPR在癌症中调控细胞凋亡的作用：分子靶点、机制及转化医学面临的挑战

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：CRISPR-Mediated Regulation of Apoptosis in Cancer: Molecular Targets, Mechanisms, and Translational Challenges

CRISPR/Cas系统通过精准调控肿瘤细胞凋亡相关通路和靶点，为克服癌症耐药性提供新策略，但其临床转化受限于肿瘤异质性、补偿机制和递送技术挑战，需结合多疗法并利用基因组筛选优化靶点选择。

　　

钱塘|孙焕 Song|郭安妮|陈媛|邵静薇

福建省癌症转移化学预防与化疗重点实验室，福州大学化学学院，中国福建省福州市350108

摘要

CRISPR/Cas系统由于其高基因编辑效率和相对较低的脱靶效应，已成为癌症研究中的关键技术平台。通过精确调节致癌信号通路和与凋亡相关的分子，CRISPR为阐明和重编程肿瘤细胞中的凋亡调控机制提供了关键工具。然而，尽管在临床前研究中取得了显著进展，但在肿瘤细胞中实现高效和选择性的凋亡诱导仍然是一个主要的转化挑战。越来越多的证据表明，基于CRISPR的策略可以通过重新编程肿瘤细胞对凋亡的敏感性来获得更有效的抗肿瘤效果，而不仅仅依赖于单基因编辑。本综述系统总结了CRISPR介导的肿瘤细胞凋亡调控的分子靶点和潜在机制，特别强调了关键的凋亡信号通路和代表性研究进展。它强调了靶向与生存相关的基因在抑制肿瘤进展和促进凋亡性细胞死亡中的关键作用。此外，本文还讨论了CRISPR与化疗或免疫疗法结合的潜在协同机制，以及基于CRISPR的功能筛选在识别凋亡调控靶点和药物耐药性相关机制方面的价值。最后，我们分析了CRISPR介导的凋亡调控在临床转化中面临的主要挑战，并提出了未来的研究方向和概念框架，以优化基于CRISPR的抗癌策略并促进其临床应用。

引言

根据国际癌症研究机构（IARC）的数据，2020年全球新诊断出1929万例癌症病例[1]。癌症本质上是一种遗传性疾病，由体细胞改变的逐渐积累驱动，这些改变会破坏细胞周期控制，促进不受控制的增殖，并使细胞永生化[2]、[3]。这些恶性表型通常是由原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活共同引起的，同时伴随着调控凋亡、代谢和免疫监视的调控网络的广泛重排[2]、[4]。在许多肿瘤中，细胞周期调节因子的异常表达、促凋亡信号的抑制以及对凋亡信号的响应减弱共同促进了肿瘤的存活和治疗抵抗[2]、[4]。因此，尽管在手术、放疗和化疗方面取得了显著进展，但多种癌症类型的复发率仍然很高，长期生存率有限[4]、[5]、[6]。

因此，抗癌治疗的一个核心目标是在选择性消除恶性细胞的同时抑制肿瘤生长。细胞死亡可以通过不同的但相互关联的方式发生，包括凋亡（程序性细胞死亡）、自噬（II型程序性细胞死亡）和坏死。值得注意的是，自噬可能具有依赖情境的促凋亡或抗凋亡效应[7]、[8]、[9]、[10]。在这些过程中，凋亡是一个由基因控制的、高度协调的程序，对组织稳态至关重要，并且是阻止恶性进展的主要屏障。重要的是，凋亡与其他与癌症相关的表型（如增殖、迁移、侵袭和黏附）通过复杂的信号网络紧密相连，而不仅仅是一个孤立的终点。经典的凋亡信号通路通过外源性死亡受体和内源性线粒体通路启动，也可以由内质网（ER）应激反应触发[11]、[12]。这些通路的失调是癌症的特征，代表了肿瘤逃避细胞死亡和产生治疗抵抗性的关键机制。

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关（CRISPR/Cas）系统由于其可编程性、操作简单性和相对于早期平台（如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）的高编辑效率，迅速成为基因组操作的基石技术[13]、[14]。在成功应用于哺乳动物基因组编辑[15]之后，CRISPR技术引起了人们对其在人类疾病（包括癌症、心血管疾病和代谢疾病）中应用的广泛兴趣[16]、[17]、[18]。在肿瘤学研究中，CRISPR能够精确干扰致癌驱动因子和凋亡相关调节因子，从而有助于剖析肿瘤存活机制并系统地识别可操作的脆弱性。此外，癌症基因组学的进步和全面的参考基因组的可用性加速了临床相关改变的发现，为基因编辑策略中的合理靶点选择提供了更坚实的基础[19]、[20]、[21]。

然而，将CRISPR介导的凋亡调控转化为具有临床意义的抗癌效果仍然具有挑战性。尽管CRISPR平台具有高精度并在临床前研究中表现出令人信服的活性，但在临床环境中一致且选择性地诱导异质性肿瘤中的凋亡尚未得到可靠实现。重要的是，基于CRISPR的基因编辑不应被视为一种独立的抗癌疗法；实际上，其临床应用受到几个基本限制的制约[22]、[23]。首先，肿瘤的异质性导致不同亚克隆之间的靶点依赖性和编辑敏感性存在差异，使得未编辑或非依赖性的细胞群体得以存活并导致肿瘤复发[24]、[25]。其次，补偿性生存通路和网络冗余可能会减弱单基因扰动的功能影响，即使实现了靶向编辑[26]、[27]。第三，递送限制（包括有限的肿瘤选择性靶向、体内转染效率不足以及剂量/安全性权衡）仍然是实现临床相关环境中有效编辑的主要瓶颈[28]、[29]。总体而言，这些挑战要求对基于CRISPR的凋亡调控进行基于转化的重新评估，更加重视通路水平的靶向和旨在降低凋亡阈值并克服抵抗机制的合理组合策略。

本综述采用问题导向的框架，总结了基于CRISPR的癌症治疗的最新进展，重点关注凋亡调控。我们概述了哺乳动物系统中的主要CRISPR基因组编辑策略、关键的凋亡通路和靶点，以及展示如何通过破坏促生存决定因素来促进肿瘤细胞凋亡的代表性研究。还讨论了将CRISPR干预与化疗或免疫疗法结合的新兴组合方法，以及识别凋亡和药物耐药性相关脆弱性的CRISPR筛选工作。总体而言，本综述强调了CRISPR介导的凋亡调控的转化挑战和临床意义，强调有效的凋亡诱导需要通路水平的靶向和合理的组合策略，而不仅仅是单基因扰动。

部分摘录

CRISPR/Cas系统基因编辑技术

CRISPR/Cas系统最初在细菌和古菌中被发现，作为抵御入侵病毒和质粒的适应性免疫机制[5]、[6]、[30]。这些系统被分为两类和六种类型（I–VI）。第2类系统，包括类型II、V和VI，由于其相对简单的效应蛋白结构而被更广泛使用[31]、[32]。在本综述中，我们重点关注用于DNA水平基因组编辑的Type II Cas9和基于dCas9的转录调控

CRISPR介导的肿瘤生存通路调节以诱导凋亡

CRISPR基干预措施不是通过触发单一的线性凋亡级联反应来促进肿瘤细胞凋亡，而是通过破坏共同维持凋亡抵抗的相互连接的促生存网络来实现的[78]、[79]。从机制上看，这些扰动集中在外源性死亡受体通路、内源性线粒体通路和与内质网（ER）相关的应激适应信号通路[80]、[81]、[82]上。重要的是，癌症中的凋亡很少通过

CRISPR介导的线粒体凋亡通路诱导

线粒体是细胞生物能量学和氧化还原稳态的中心枢纽，对肿瘤的发生、进展、存活和转移具有广泛影响[153]。先前的综述已经描述了线粒体程序如何与调控细胞死亡、氧化应激、致癌信号和肿瘤发生过程中的线粒体基因改变相互作用[154]。此外，与线粒体相关的代谢重编程（包括但不限于Warburg表型）也起到了支持作用

UPR信号作为CRISPR可访问的凋亡开关

内质网（ER）是一种多功能膜结合细胞器，整合了蛋白质折叠和质量控制、脂质生物合成、钙稳态和自噬，从而维持细胞蛋白稳态和代谢平衡[185]、[186]、[187]。由致癌信号、营养/氧化还原失衡、缺氧或治疗压力驱动的细胞内稳态紊乱会损害ER功能，促进未折叠或错误折叠蛋白质的积累

基于CRISPR的组合策略以增强凋亡诱导

传统的抗癌疗法，包括化疗、放疗和新兴的物理或免疫疗法，主要依赖于外源性细胞毒性应激来消除肿瘤细胞。然而，持久的治疗反应经常受到内在或获得性抵抗机制的破坏，这些机制会提高凋亡阈值并降低治疗效果。在这种情况下，基于CRISPR的基因组编辑不仅作为一种独立的细胞毒性手段出现，还作为一种增敏手段

全基因组CRISPR筛选凋亡脆弱性

虽然基于CRISPR的个别基因扰动为癌症中的凋亡诱导提供了令人信服的证据，但其更广泛的变革性影响在于无偏见的、全基因组规模的筛选方法，这些方法能够系统地识别凋亡相关脆弱性。与传统的药物发现流程相比，后者成本高昂、耗时且通常基于假设，CRISPR筛选提供了一种强大且可扩展的方法来探究遗传依赖性

结论和CRISPR介导的凋亡调控的临床定位

CRISPR/Cas技术能够精确地研究和操纵调控肿瘤存活和凋亡能力的遗传程序。本综述总结的证据表明，CRISPR介导的致癌驱动因子、应激反应通路和调控网络的靶向可以有效降低多种癌症环境中的凋亡阈值，使CRISPR成为识别凋亡相关脆弱性的强大工具。重要的是，CRISPR是

CRediT作者贡献声明

邵静薇：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、项目管理、资金获取、概念化。陈媛：撰写——审阅与编辑、验证、研究。钱塘：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、概念化。孙焕 Song：撰写——原始草稿、验证、方法学、概念化。郭安妮：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本研究报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82172767）的支持。