基于CRISPR/Cas12a和Au@UiO-66纳米酶协同双重扩增的电化学生物传感器，用于超灵敏的ctDNA检测

《Bioelectrochemistry》：CRISPR/Cas12a and Au@UiO-66 nanozyme synergistic dual amplification-based electrochemical biosensor for ultrasensitive ctDNA detection

该研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a与Au@UiO-66纳米酶协同双重信号放大的电化学生物传感器，实现乳腺癌标志物ctDNA的超高灵敏度检测（检测限6.14 fM），无需预扩增步骤，显著简化检测流程并降低背景干扰。

　　

杨明珠|李杜娟|王傲|张一凡|欧阳佳乐|王欣怡|梁宏|童定一|王明华|林建汉|罗琼|王高峰

中国杭州电子科技大学电子与信息学院智能微传感器与微系统工程研究中心，杭州310018

摘要

乳腺癌是一种全球范围内女性中普遍存在的恶性肿瘤，早期诊断对于改善患者预后至关重要，而循环肿瘤DNA（ctDNA）是其中的关键生物标志物。在本研究中，开发了一种基于CRISPR/Cas12a和Au@UiO-66纳米酶协同双扩增的电化学生物传感器，以实现ctDNA的超灵敏检测。Au@UiO-66修饰的单链DNA探针通过硫醇基团锚定在金电极上。完整的单链DNA探针将Au@UiO-66纳米酶固定在电极上，其过氧化物酶样活性能够有效催化H₂O₂的还原，从而产生放大的还原峰电流。目标ctDNA通过与crRNA特异性结合激活Cas12a的转切割能力。在目标存在的情况下，Au@UiO-66纳米酶被释放，导致与H₂O₂还原相关的峰电流显著下降。得益于优化的实验条件，该生物传感器对目标ctDNA显示出宽的线性检测范围（从10 fM到10 nM），并且检测限极低，仅为6.14 fM。在人类血清样本中的成功检测证明了其实用性。该平台的高特异性归因于可编程的crRNA设计，能够检测特定的DNA序列，并显示出在诊断多种遗传目标方面的显著适应性，突显了其在临床癌症诊断中的潜力。

引言

乳腺癌是全球范围内最常见的女性恶性肿瘤之一，仍然是癌症相关死亡的主要原因[1]、[2]。早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。研究表明，大约70%的乳腺癌与PI3K信号通路的异常激活有关，其中PIK3CA基因H1047R位点突变是驱动肿瘤发展的关键分子标志物，可以作为早期诊断和精准治疗的重要靶点[3]、[4]、[5]。循环肿瘤DNA（ctDNA）是液体活检的核心生物标志物，携带肿瘤特异性突变（如PIK3CA H1047R），可以无创地反映肿瘤动态[6]、[7]。然而，由于血液中ctDNA的浓度极低（通常低于pM水平）[8]、[9]，其检测仍然是一个巨大的挑战[10]。目前，已经开发了几种ctDNA检测方法，包括定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）和下一代测序（NGS）[11]、[12]。qPCR简单且应用广泛，但在检测超低丰度突变序列时其灵敏度和准确性可能受到限制。dPCR提供了更高的灵敏度和绝对定量能力，但仍需要复杂的仪器和相对较高的成本[13]。NGS提供了全面的基因组信息和多重分析，但通常与复杂的样本处理、较长的周转时间和对专用平台的强烈依赖性相关[14]。尽管当前主流方法具有高灵敏度，但仍存在一些问题，如高成本、长周期和设备依赖性强[15]。因此，开发一种新型的ctDNA检测方法，该方法具有高灵敏度、成本效益高且用户友好，具有重要的临床价值[16]、[17]。

近年来，CRISPR/Cas系统在核酸检测方面展现了显著的潜力，因为它能够高度特异性地识别目标序列[18]、[19]、[20]。Cas12a在识别特定目标DNA后可以激活转切割活性，从而降解周围的单链DNA（ssDNA），实现信号放大[21]、[22]。利用这一独特特性，CRISPR/Cas12a已被广泛用于高灵敏度的核酸检测[23]、[24]、[25]。研究人员通过多种信号放大策略开发了各种基于CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器。吴等人（2022年）[26]设计了一种金纳米粒子（AuNPs）增强的CRISPR电化学传感器，用于检测SARS-CoV-2变异株。该方法在100 fM到10 nM的动态范围内达到了50 fM的检测限。何等人（2022年）[27]提出了一种结合PCR预扩增和CRISPR/Cas12a转切割的双信号放大策略。在这种策略中，PCR扩增的细菌基因组DNA目标激活了Cas12a，后者特异性切割发夹DNA电化学探针。与传统PCR方法相比，这种策略将检测灵敏度提高了三个数量级。

尽管在核酸检测方面表现出优异的灵敏度和特异性，但大多数方法仍然依赖于预扩增步骤，如重组酶聚合酶扩增（RPA）来增强信号输出并实现更低的检测限[28]、[29]、[30]。然而，这些扩增步骤不仅增加了检测工作流程的复杂性，还可能引入非特异性扩增干扰，从而影响检测准确性和实际应用性[18]。因此，迫切需要开发无需扩增的CRISPR/Cas电化学生物传感器，以简化检测程序并减少背景噪声。

为了克服这些挑战，引入了一种纳米酶催化的信号放大机制来提高电化学生物传感器的检测能力。当Cas12a识别目标DNA时，它会持续降解周围的ssDNA，实现信号放大而无需额外的探针。这一过程有效减少了背景干扰并提高了检测灵敏度。纳米酶是一类具有酶模拟催化活性的纳米材料[31]。由于它们的高催化效率、高稳定性和可规模化生产，近年来在生物传感中得到了广泛应用[32]。其中，金属有机框架（MOF）基纳米酶由于其多孔结构、高比表面积和优异的生物相容性，提供了大量的催化位点，大大增加了电化学信号输出[33]、[34]。因此，将纳米酶催化的信号放大策略与CRISPR/Cas12a的自信号放大相结合，有望实现一个无需扩增、灵敏度更高且背景噪声更低的检测平台。

在这里，通过结合CRISPR/Cas12a的转切割功能和Au@UiO-66纳米酶的过氧化物酶样能力，建立了一种新型的双信号放大电化学传感平台，用于检测与乳腺癌相关的ctDNA。如图1所示，首先用硫醇修饰的单链DNA对金电极（AuE）进行功能化。随后，SH-ssDNA与Au@UiO-66纳米酶结合形成信号探针。Au@UiO-66纳米酶催化H₂O₂的还原反应，产生明显的峰电流。当目标DNA存在时，crRNA特异性结合到目标DNA上，激活Cas12a的转切割能力。接下来，Cas12a在电极表面随机切割SH-ssDNA，导致固定的Au@UiO-66纳米酶数量显著减少，从而导致H₂O₂还原峰电流相应下降。在没有目标的情况下，Cas12a保持不活跃状态，使SH-ssDNA牢固地锚定在电极表面，从而保持较强的还原峰电流。通过测量峰电流的变化，该传感系统能够定量测量目标DNA。

材料与仪器

上海桑贡生物科技有限公司（中国上海）提供了Cas12a。柠檬酸钠和6-巯基己醇（MCH）从Macklin生化有限公司（中国上海）获得。Aladdin试剂公司（中国上海）提供了1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。UiO-66从Chemsoon有限公司（中国上海）购买。K₃[Fe(CN)₆]从国药化学试剂有限公司（中国上海）购买。所有RNA和DNA均

Au@UiO-66纳米复合材料的表征

使用透射电子显微镜（TEM）对样品进行了表征和分析，证明了Au@UiO-66的成功合成。具体的实验过程如下：将待测试样品均匀分散在无水乙醇中，并进行10分钟的超声处理，以确保样品完全分散。然后，将适量的悬浮液滴在覆盖有碳支撑膜的铜网上。乙醇自然蒸发后，进行TEM观察

结论

本研究报道了一种基于CRISPR/Cas12a和Au@UiO-66纳米酶的协同双扩增方法的电化学生物传感器的开发，用于ctDNA的超灵敏检测。该平台无需预扩增即可直接分析ctDNA，提供了一种显著简化且高效的DNA检测方法。通过CRISPR/Cas12a介导的精确目标识别和

CRediT作者贡献声明

杨明珠：撰写——原始草案、验证、方法学、实验研究。李杜娟：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取、概念化。王傲：实验研究。张一凡：验证。欧阳佳乐：验证。王欣怡：撰写——审阅与编辑、资金获取。梁宏：撰写——审阅与编辑、监督、资源协调。童定一：撰写——审阅与编辑。王明华：撰写——审阅与编辑。林建汉：资源协调。罗琼：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了浙江省自然科学基金（项目编号：LY24F010008、LQ24H180009）、浙江省属高校基本科研业务费（项目编号：GK259909299001-403、GK259909299001-017）、国家自然科学基金重点支持项目（项目编号：92373202、62141409）、浙江省医疗卫生科技计划（项目编号：2024KY1634）以及山西省基础研究计划（项目编号：20210302123367）的支持。