综述：多糖的链构象表征：当前策略、挑战与新兴技术

《Glycoscience & Therapy》：Chain Conformation Characterization of Polysaccharides: Current Strategies, Challenges, and Emerging Technologies

　　

多糖是自然界中第三大类多样的生物聚合物，仅次于蛋白质和核酸。结构决定活性。越来越多的证据表明，多糖的构象强烈影响其物理化学性质和生物活性。阐明多糖链的刚性、柔性和详细链参数，有助于研究人员更好地将多糖应用于食品、制药和材料科学领域。目前，光散射方法（如激光光散射（LLS）/动态光散射（DLS）/尺寸排阻色谱联用多角度激光光散射（SEC-MALS））、显微镜技术（如原子力显微镜（AFM）/透射电子显微镜（TEM）/扫描电子显微镜（SEM））和计算建模（如分子动力学（MD）模拟）为溶液中的链尺寸、构象转变和聚集行为提供了有价值的见解。本综述总结了用于研究多糖构象的主要分析技术，包括光谱学、散射学、显微镜学、流体力学和计算方法。研究人员旨在为探索多糖构象、建立构效关系以及推动多糖在食品、化妆品和生物医学领域的应用提供实用指南。

本综述系统总结了多糖链构象表征的当前策略、挑战与新兴技术，涵盖从基础定义到前沿方法的多个层面。论文主体内容围绕多糖构象的定义、表征方法、构象变化检测以及新兴技术展开，旨在为多糖构效关系研究提供全面参考。

**1. 引言**
多糖是自然界中仅次于蛋白质和核酸的第三大类多样生物聚合物，由多种单糖残基通过糖苷键连接而成，具有不同的构型和分支模式。除了化学结构（也称为一级结构，包括单糖组成、糖苷键类型、糖苷连接、糖序列和分支）外，多糖还具有其他维度水平的结构，包括二级结构（分子量或尺寸、链形状或构象）以及三级或超分子结构甚至宏观结构，如聚集体、晶粒和取向，这些对其物理化学性质和生物活性至关重要。其中，链构象是多糖研究中理性设计和构效关联的基石，但由于确定单链构象的挑战，在已报道工作中常被忽视。首先，构象影响多糖的物理化学性质，如粘度、溶解度和宏观性质（如凝胶化）。例如，普鲁兰或葡聚糖的柔性无规线团构象导致高溶解度和低粘度，而黄原胶作为一种双螺旋多糖，因其在水中的高粘度而广为人知，常作为增稠剂应用于食品领域。此外，值得注意的是，分子内和分子间氢键以及碳环的疏水性也有助于多糖链的整体形状，导致多糖的不同功能。例如，在材料科学中，海藻酸盐和壳聚糖链的构象和相互作用决定了其凝胶化和机械性能，可进一步用于制造多种材料，并广泛应用于食品和农业等领域。此外，越来越多的报告总结认为，多糖的生物活性与其链构象密切相关。例如，β-1,3-葡聚糖（如香菇多糖（LNT）、裂褶菌多糖（SPG）和海带多糖）的免疫调节、抗肿瘤活性和抗病毒效应通常与其三螺旋构象相关，当三螺旋转变为单螺旋或无规线团时，这些活性会降低。目前，多糖被认为具有益生元效应，可以通过维持肠道微生物平衡来影响人类健康。近期研究表明，不同多糖对细菌菌株的促进作用差异很大。这些作用并非由多糖的单糖成分决定，而是由多糖本身的复杂空间结构与细菌独特的遗传组成共同决定。因此，构象特征对于理解多糖的物理化学和生物功能至关重要，包括链柔性、分子间组装、氢键网络和构效关联。结构蛋白质组学经历了深刻变革，但与蛋白质和多核苷酸相比，由于多糖化学结构的复杂性，当前多糖链构象的表征仍具挑战性。天然多糖通常是混合物，具有不同的糖组成、糖苷构型、糖苷连接、链长、分支度和不同类型的修饰。即使从相同生物来源提取，也难以获得结构完全均匀的样品。更重要的是，大多数聚合物的链构象高度可变，并强烈受环境和化学因素影响，如溶剂极性、pH、离子强度和取代度，这使构象表征难度呈指数级增加。尽管已采用多种技术表征多糖链构象，如静态和动态光散射（SLS/DLS）、尺寸排阻色谱联用激光光散射（SEC-LLS）、原子力显微镜（AFM）和分子动力学（MD）模拟，研究人员仍在寻求多尺度、时间分辨和高通量方法。本综述总结了当前多糖构象表征方法的原理、优缺点以及详细实验条件、适用范围等。

**2. 多糖构象的定义**
**2.1 多糖的层次结构组织**
通常，多糖的结构层次可在概念上分为四个级别：（1）一级结构，也称为化学结构，包括单糖组成和序列、糖苷构型（α-或β-构型）、糖苷连接（如1→3或1→4连接）、分支点和分支长度；（2）二级结构，也称为链构象，指链在空间中的规则排列或周期性构型，在三维空间中表现出一定程度的延伸性和重复性，如单螺旋、双螺旋或三螺旋、无规线团和类球链，取决于分子量；（3）三级或超分子结构，通过氢键、疏水或亲水相互作用或静电作用组装形成纳米纤维、纳米凝胶、纳米颗粒等；（4）宏观结构，块体形态和材料级组装（膜、纤维、凝胶等）。为更好理解多糖的层次结构组织，以凝胶多糖（CUR）和裂褶菌多糖（SPG）为例。如图1A所示，CUR的一级结构是线性β-(1→3)-D-葡聚糖，而SPG由β-(1→3)-D-葡聚糖主链组成，每三个主链β-(1→3)-D-葡萄糖残基有一个单β-(1→6)-D-葡糖基残基作为分支，两者在自然状态下均采用三螺旋构象，但螺距和直径不同。图1B展示了巴氏杆菌B型和E型以及结构相关荚膜多糖的构象比较。如图1C所示，从池栖微囊藻提取的蓝藻多糖sacran可从纳米尺度到微米尺度自组装成扭曲纤维，直径约1 μm，长度超过800 μm。此外，从木耳中提取的多糖BFP的链可形成平行排列的层状结构，随后通过氢键和亲水或疏水相互作用自卷曲成纳米管，其尺寸可通过BFP的浓度和分子量控制（图1D）。

**2.2 多糖构象的类型**
对于迄今为止报道的所有多糖，其化学结构信息通常可用，但空间构象数据却很少可用。一般来说，多糖具有几种典型构象（图2）：（1）无规线团或柔性链，中性多糖的最典型构象，如葡聚糖和普鲁兰；（2）单螺旋链，常见于直链淀粉，由链内氢键稳定；（3）双螺旋链，黄原胶和支链淀粉的特征；（4）三螺旋链，通常发现于β-(1→6)分支的β-(1→3)-葡聚糖，如CUR、SPG、硬葡聚糖（SCG）和LNT，通常由链间氢键和疏水相互作用稳定；（5）半刚性或蠕虫状链，高电荷多糖中高度常见，如壳聚糖和海藻酸盐在特定离子条件下；（6）刚性或棒状链，通常为低分子量螺旋多糖，如重均分子量（M_w）低于5.0 × 10⁵的SPG和M_w低于2.4 × 10⁵的黄原胶，以及一些水不溶性多糖，如甲壳素和纤维素；（7）超支化或球链，常观察于超支化多糖，由于分子间氢键，如从茯苓中提取的多糖。表1列出了代表性的多糖链构象示例。

**2.3 多糖构象的形成和稳定机制**
多糖构象在不同环境中的形成和稳定是复杂过程。构象的形成主要由几何约束（骨架结构）决定，而其稳定性主要通过非共价相互作用（分子间/分子内力）和环境因素维持。因此，即使具有相同化学结构（一级结构），如前述的SPG和硬葡聚糖，其三螺旋构象参数也不同。
**2.3.1 构象形成的决定因素**
一级结构支配多糖链的构象，包括单糖组成、糖苷连接模式、取代基、分支度和衍生化。单糖环不是平面的，而是采取折叠构象。通常，吡喃糖最稳定的构象是椅式构象，由于环结构的刚性。这种刚性为多糖链提供了相对坚固的“节点”。在特定条件下，或在酶催化中间体中，可能产生半椅式、船式或扭曲船式构象，但这些能量较高。糖苷键的扭转角（?, ψ）构成多糖链构象中最关键的“铰链”。两个坚固的单糖环通过糖苷氧原子连接，链的柔性主要来源于键的旋转。键合键的几何类型（α与β）也影响构象。据报道，β-连接相比α-连接更倾向于延伸或螺旋构象。分支链限制旋转自由度并增强溶解度，但可能抑制长螺距螺旋形成。
**2.3.2 构象稳定机制**
通常，多糖链构象通过非共价相互作用在特定环境中稳定，如氢键、静电作用、范德华力和疏水效应。由于多糖含有大量羟基（-OH），分子内和分子间氢键稳定其构象。尽管多糖高度亲水，但糖环结构的某些面是疏水的（含CH基团）。以SPG的三螺旋构象为例（图1A）：分子内H键维持螺旋结构，三条链的2-OH基团间的分子间H键支持三螺旋的稳定性。此外，此三螺旋结构的内部腔体相应疏水，因为葡萄糖单元的2-OH侧是疏水的，类似于环糊精的疏水内部腔体。对于带电多糖，如海藻酸盐、果胶和壳聚糖，也发生静电相互作用。
**2.3.3 环境因素的影响**
多糖构象不是静态的，也可能响应外部条件（如溶剂类型、温度和pH）进行动态调整。例如，通过加入二甲基亚砜（DMSO）或碱性溶液（如1 M NaOH），三螺旋构象可被破坏为单无规线团，这是氢键断裂的结果。CUR是一种线性β-1,3-葡聚糖，在真空中形成高度稳定的右手三螺旋结构，可在65 °C下解离为单螺旋，并在冷却时形成凝胶网络。
综上所述，链构象是多糖在生物体中发挥各种功能的基础，包括提供结构支持、参与信号识别和储存能量。这也是多糖在食品、制药、化妆品和材料科学领域如此广泛应用的关键原因。

**3. 当前可用的多糖构象表征方法**
如今，多种技术用于表征多糖链构象，包括常用方法如静态和动态光散射（SLS/DLS）、原子力显微镜（AFM）和分子动力学（MD）模拟。值得注意的是，这些表征方法在描述多糖构象方面的准确性各不相同，不同方法适用于不同应用。因此，有必要系统回顾这些方法的原理、使用注意事项、适用多糖类型和具体应用场景。
**3.1 静态光散射和动态光散射**
**3.1.1 原理和可测量参数**
在当前聚合物构象表征方法中，光散射方法（即SLS和DLS）是确定稀溶液中多糖链平均尺寸和形状的基本工具。SLS用于测量散射光强的角度和浓度依赖性，以确定绝对分子量（M_w）、回转半径（R_g）和第二维里系数（A₂）。基本关系由Zimm方程描述。DLS测量用于表征溶液中多糖的流体力学半径（R_h），常通过CONTIN程序分析。平均流体力学半径（〈R_h〉）可通过Stokes–Einstein方程计算。
**3.1.2 操作要点**
溶剂和多糖溶液必须经过光学纯化，以避免非多糖本身散射光强的贡献。与小分子不同，多糖易于聚集。因此，对于SLS/DLS测量，确保多糖分子在溶液中以稳定分散的单链（或单个颗粒）形式存在且相互作用可忽略，以获得其真实内在性质，这非常重要。这主要是为什么在溶剂选择、浓度测定和样品预处理时需特别小心。通常，应制备不同浓度（超过5个浓度）的多糖溶液，其中多糖应在选定溶剂中通过温和搅拌完全溶解，确保离心或过滤光学纯化后浓度不变。对于DLS测量，常在散射角30~90°下检查不同浓度多糖溶液散射强度的时间波动。此外，通过外推θ和c因子至θ = 0和c = 0从DLS获得详细的R_h值。对于球形超支化多糖，散射强度不依赖于角度，可使用固定角90°。随后，一旦使用DLS确定了多糖的适当浓度，可用于SLS检测。在多个稀释浓度和角度（30°–150°）下进行，以测定多糖溶液的平均散射强度。dn/dc值应在相同条件下测量，因为即使±0.002的偏差也可能导致>10%的M_w误差。数据用Zimm或Berry图分析，以获得截距（M_w^-1或M_w^-1/2）和斜率（与R_g相关）。例如，如图3A所示，甲壳素样品在极稀溶液（0.02–0.06 mg/mL）中的Zimm图显示出良好的线性关系，从截距和外推斜率容易计算出M_w和R_g值，甲壳素的M_w为53.3 × 10⁴ g mol^-1，R_g为113.7 nm。
**3.1.3 关键构象参数**
流体力学因子ρ。结合SLS和DLS得到流体力学因子ρ，这是一种无量纲结构敏感参数，通常用于评估具有相对较窄分子量分布聚合物的刚性。ρ值约0.77表示紧密球，1.3–1.8对应无规线团，>2.0表示伸长或刚性棒状结构。ρ通常按以下方式获得：ρ = R_g/R_h。标度指数（ν）。绘制log R_g对log M_w得到不同链构象的标度指数（ν）：ν ≈ 0–0.33指紧密球；ν ≈ 0.5–0.6指无规线团；ν ≈ 0.5–1.0指半刚性构象，刚性随ν增加而增加；ν ≈ 1指棒状链。为获得此标度指数，必须获得几个具有不同M_w的分子分散多糖，通常通过降解如超声或酶方法获得。例如，Meng等人通过超声方法获得了9个窄分子量分布的BFP多糖级分（图3B），log R_g对log M_w给出ν ≈ 0.9，接近1，表明BFP具有相当大的刚性。持久长度（q）和单位轮廓长度摩尔质量（M_L）通过M_w和R_g获得。尽管标度指数（ν）和流体力学因子（ρ）可以粗略预测多糖链的刚性，但链的精细构象形状和详细参数仍未知。因此，持久长度（q）和单位轮廓长度摩尔质量（M_L）的构象参数也可用于识别特定构象。Benoit–Doty方程（BD理论）已用于计算M_L，Zhang等人简化了Benoit–Doty方程。这些方程允许从截距和斜率最终确定M_L和q。对于螺旋多糖，螺旋链数（n_s）和螺旋螺距（h）可通过以下方程估算：n_s = M_w/M_w,s，h = (M₀ /x)/(M_L / n_s)，其中M_w,s和M₀分别指单个多糖及其重复单元的分子量，x指主链重复单元上的葡糖基基数。以0.01 M水溶液中的黄原胶为例。如图3C所示，由黄原胶在0.01 M水溶液中的数据构建的(M_w²/(12R_g²))^2/3对M_w图，得到M_L和q值分别为1,900 nm^-1和75 nm。结合黄原胶双螺旋结构（n_s ? 2）每个重复单元的摩尔质量（M₀）为891 g mol^-1，螺旋大分子的螺距（h）估计为0.47 ± 0.02 nm，与X射线衍射的黄原胶二聚体结果一致。此外，平移扩散系数（D）也可用于评估M_L和q，根据Xu等人的方法。他们基于蠕虫状圆柱体的平移摩擦系数Yamakawa–Fujii理论，通过粗粒化异质多糖分子分析了异质多糖的D数据，如图3D所示，得到M_L和q值分别为1,350 nm^-1和10 nm。
**3.1.4 优缺点**
结合DLS和LLS测量多糖链在溶液中的构象是目前最基本的方法：从DLS获得的R_h，结合从LLS获得的M_w和R_g，可以计算构象参数。DLS/LLS是非侵入性的，需要最少的样品量，并且无需标记或固定即可进行分析，从而反映最真实的构象状态。最重要的是，DLS/LLS可用于监测多糖与其他成分之间的构象转变、聚集行为和溶剂相互作用。然而，对于DLS/LLS测量，必须考虑几个局限性。它们对样品纯度高度敏感，即使痕量污染物也会主导散射信号并扭曲结果；因此，强烈建议进行过滤或超速离心等纯化步骤。此外，多糖通常表现出宽多分散性，导致链聚集，使分子量误差较大。此外，DLS/LLS无法提供链的原子级结构细节。总之，虽然DLS/LLS是多糖准确、快速、溶液相构象表征的强大工具，但其有效性取决于仔细的样品制备和适当的浓度范围以确保准确性。

**3.2 结合光散射的粘度分析**
**3.2.1 原理和可测量参数**
粘度分析是评估链构象的简单方法，特别是与光散射方法结合时。获得的本征粘度（[η]）反映了多糖分子由于溶剂-聚合物相互作用占据的流体力学体积。在良溶剂中，广泛的聚合物-溶剂相互作用导致链扩张，导致更高的[η]值，而在不良溶剂中，链塌缩成无规线团，[η]降低。因此，[η]值可作为稀溶液中多糖构象状态和溶剂化行为的灵敏探针。
**3.2.2 操作要点**
多糖溶液的[η]值通常使用乌氏（Ubbelohde）型毛细管粘度计在固定温度（± 0.01 °C）下测量。通常，选择溶剂流出时间较长的粘度计（例如t₀ ≥ 200 s）可以确保多糖溶液的牛顿流动并忽略动能校正。测量不同浓度（c）溶液的流动时间（t）。计算相对粘度（η_r=t/t₀）和比粘度（η_sp=η_r?1）。绘制η_sp/c~c和(lnη_r)/c~c，通过外推c至零使用以下Huggins和Kraemer方程计算[η]：η_sp/c = [η] + k[η]²c，ln(η_r/c) = [η] ? β[η]²c，其中k和β是给定聚合物在所需条件下的常数，η_sp/c是比浓粘度，(lnη_r)/c是特性粘数。
**3.2.3 关键构象参数**
Mark–Houwink关系。使用M_w（SLS）和[η]（粘度），生成log[η]对logM_w图，拟合到Mark–Houwink方程：[η] = KM_w^α。通常，为建立此方程，需要制备窄分子量分布的多糖级分。α值指示可能的链构象，如0–0.5为球或紧密线团，0.5–0.8为θ溶剂和良溶剂中的无规线团，1.7–2为刚性棒。这些参数对于初步比较评估很有价值。通过M_w和[η]获得的持久长度（q）和单位轮廓长度摩尔质量（M_L）。众所周知，Yamakawa等人和Bohdanecky等人基于蠕虫状甚至螺旋蠕虫状链模型（HW）提出了一系列公式，通过构象参数评估大分子的刚性，计算繁琐。然后，Bohdanecky等人简化了M_w和[η]之间的关系。基于蠕虫状圆柱体占据的流体力学体积等于大分子的偏比体积的假设，Bohdanecky等人获得了以下公式。代入偏比体积（多糖的值为0.68 cm³g^-1）和计算的A_η和B_η，我们可以获得d_r²/A₀，这可以通过近似经验公式描述。从这些公式，d_r得以获得，A₀也通过公式获得。相应地，可以从公式计算M_L和q。以三螺旋多糖BFP为例。从BFP级分的(M_w²/[η])^1/3对M_w^1/2图（图3F），计算得到M_L、q和d的参数分别为3,362 nm^-1、192 nm和4.6 nm。q远高于SPG在0.01 M NaOH水溶液中三聚体的q（150 nm），表明BFP比SPG具有更大的刚性。注意，使用的[η]值应独立于剪切速率。如果多糖溶液的流动行为表现出剪切速率依赖性，应使用多球低剪切速率粘度计获得零剪切速率本征粘度[η]₀。
**3.2.4 优缺点**
粘度分析成本低且简单，使其可被大多数实验室访问。粘度的样品纯度要求不如光散射方法严格。此外，获得的本征粘度[η]可用于通过Mark–Houwink方程估算分子量。结合LLS和[η]，可以提供详细的构象参数，如M_L、q、α和d。此外，粘度测定可以在广泛的浓度范围内进行，并且与许多溶剂系统兼容。然而，分子量的准确性取决于适当的Mark–Houwink常数和样品的多分散性。值得注意的是，在没有散射方法（LLS/DLS或SEC-LLS）的帮助下，它无法提供构象参数。测量对实验条件敏感，包括温度、剪切速率和浓度，因此需要具有精确控制温度的恒温槽、能够校正剪切力的乌氏粘度计和适当的浓度范围。总之，虽然粘度法是多糖溶液初步表征的有价值且简单的工具，但其局限性需要互补技术进行综合结构分析。

**3.3 激光光散射联用尺寸排阻色谱和在线粘度计**
**3.3.1 原理和可测量参数**
显然，混合技术相比上述传统方法节省了大量时间。随着科学技术的快速发展，混合技术如尺寸排阻色谱（SEC）联用LLS（SEC-LLS），甚至联用在线粘度计（SEC-LLS-Vis）已开发用于精确测定分子量分布和分子分离过程中的构象变化。SEC通常被视为尺寸排阻色谱，根据多糖分子穿透多孔填料孔隙的概率依赖于其分子尺寸来分离多糖。然后，多糖的洗脱级分通过多角度LLS以及差示折光率（RI）检测器和粘度检测器在线检测。
**3.3.2 操作要点**
同样，用于SEC-LLS测量的样品必须完全溶解，以防堵塞色谱柱。应在与LLS检测使用的相同激光波长、温度和缓冲液中准确测量dn/dc。色柱应匹配预期的分子量窗口，对于高分子量多糖（> 10⁶ Da），预柱过滤器（0.1–0.2 μm）是必不可少的。其他操作要点与SLS/DLS测量相同。
**3.3.3 关键构象参数**
该系统直接测量多糖的绝对M_w、R_g和[η]，然后可以确定多糖的溶液构象。然后，基于上述方法，也可以计算上述参数，包括ρ、[η] = KM^α、M_L、d和q。此外，窄而对称的LS信号分布可以表明提取多糖的纯度，这非常简单直接。例如，未纯化的LNT通过SEC-LLS显示溶液中存在少量聚集体（12.6%），M_w > 2 × 10⁶。
**3.3.4 优缺点**
SEC–LLS–Vis可以将SEC、SLS和粘度集成在一起，获得所有M_w、[η]和R_g，这非常方便，是大多数研究人员的首选。软件可以启用构象参数的直接计算，如Mark–Houwink指数（α）和R_g/R_h比率。更重要的是，该技术可以检测和量化分散样品中的异质性，这意味着无需像LLS那样制备多个不同分子量的多糖样品。这是大多数研究人员选择此方法的主要原因。然而，与上述传统方法相比，SEC–LLS–Vis检测的是样品经色谱柱洗脱后的信号，而非原始溶液浓度下的真实状态，后者可能处于动态平衡。特别是，SEC–LLS–Vis可用的溶剂严重依赖于色谱柱的类型。因此，在研究构象如何随因素（如流动相流速、溶剂和温度）变化时，存在一定局限性。另一方面，SLS使用光散射池，这意味着它不受流动速度或所用溶剂的限制。

**3.4 分子动力学模拟**
**3.4.1 原理和可测量参数**
随着计算能力和模拟方法学的发展，分子动力学（MD）模拟使探索多糖链构象的可及构象空间和相对稳定性成为可能。MD是一种计算技术，使用经过验证的力场根据经典牛顿力学模拟原子随时间的运动。如今，MD生成原子轨迹，从中可以分析扭转动力学、氢键模式和溶剂介导的相互作用。在大多数多糖研究中，MD通常用于分析时间依赖的糖苷键扭转波动、氢键网络、链刚性和溶剂相互作用。通过平衡轨迹分析，可以获得基于集体平均的结构和动力学参数。这些包括旋转半径、末端距离、氢键数和扭转角（φ, ψ）分布。这些参数提供有关分子构象偏好的统计信息，而非特定和唯一的结构。
**3.4.2 操作要点**
首先，需要定义多糖的化学结构，包括链长、连接模式和分支，然后MD模拟通常从原子坐标开始。通常包含显式溶剂分子，并根据需要添加对离子以确保系统的整体电中性。第二步涉及力场的选择及其参数的优化。常用的碳水化合物力场包括GLYCAM06和CHARMM36，能够准确描述糖苷键的扭转和氢键相互作用。在模拟过程中，必须确保关键参数（