关于抗体驱动的小鼠原代T细胞激活离体检测方法的详细全面概述

《Journal of Immunological Methods》：A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex-vivo assays for primary murine T cell activation

T细胞激活机制研究及方法标准化评估：通过对比不同抗体剂量、固定化方式和辅助细胞存在与否，系统分析对CD25/CD69/CD44等表位及IL-2/IFN-γ分泌的影响，建立多参数评估体系，为优化体外T细胞激活实验提供实验依据和实践指南。

　　

Floralba Gjergjova|Sandra Pelka|Bhakti Chavda|Ranee Harrison|Yair Botbol

摘要

T细胞活化是适应性免疫中的基本过程，需要通过T细胞受体/CD3复合体和共刺激途径精确协调信号传导。体外小鼠T细胞活化实验是研究这些信号机制的关键工具。它们在基础机制理解与临床应用之间架起了桥梁，应用范围涵盖癌症免疫疗法和传染病治疗。这些实验提供了可控的实验平台，用于剖析T细胞生物学、筛选治疗化合物，并识别调控免疫反应的新信号通路。尽管经过数十年的研究且T细胞活化实验被广泛使用，但不同实验室之间存在显著的方法学差异，这给数据解释和实验重复性带来了挑战。为了解决这一问题，我们对常见的抗体驱动的T细胞活化实验进行了对比分析，考察了抗体剂量、实验形式以及辅助细胞的存在与否等关键变量。通过整合多个参数的测量结果，我们提供了基于实验的证据，说明这些不同的刺激方法如何调节早期T细胞活化的多个关键参数。基于这些证据，我们讨论了在选择不同方法时应考虑的因素，并提供了建立和改进此类实验工作流程的实际指南。

引言

T细胞是适应性免疫系统的核心组成部分，通过识别、攻击和调节对病原体、癌细胞和其他外来威胁的反应来维持健康和免疫平衡（Sun等人，2023年）。T细胞活化的经典途径需要整合三种不同的信号（Omar等人，2025年）：首先通过T细胞受体（TCR）/CD3复合体进行初级活化，然后主要通过CD28结合激活共刺激途径。在生理条件下，这些信号由抗原呈递细胞（APCs）通过两种关键相互作用提供。第一个信号是通过肽-主要组织相容性复合体（pMHC）与TCR的相互作用传递的，而第二个信号则是通过共刺激配体（如CD80/CD86）与T细胞上的CD28受体结合传递的（Shah等人，2021年；Hennecke和Wiley，2001年；Lim等人，2012年）。此外，微环境中的细胞因子提供了第三个信号，对指导T细胞极化、存活和分化为适当的T细胞亚群至关重要（Curtsinger和Mescher，2010年）。

为了在体外重现这一过程，研究人员开发了多种方法，使用化学试剂（例如PHA、PMA/离子霉素）、单克隆激活抗体（mAcAb）以及与辅助细胞的共培养，每种方法都有其独特的优势和局限性（Hashimoto等人，1991年；Lee等人，2023年；Mandala等人，2021年；Trickett和Kwan，2003年）。1987年，Leo等人首次鉴定出针对小鼠CD3ε的单克隆激活抗体145-2C11，它至今仍是小鼠TCR/CD3刺激的金标准（Leo等人，1987年）。随后，Gross等人鉴定出了αCD28抗体37.51，该抗体被广泛用作小鼠T细胞的强效共刺激剂（Gross等人，1992年）。早期研究确立了一个基本的实验原理：有效的T细胞活化需要将αCD3抗体固定在固体支持物上（如细胞培养板或珠子），以模拟APC-T细胞相互作用过程中TCR/CD3复合体的自然聚集（Walker等人，1987年；van Lier等人，1989年）。单独使用可溶性抗体通常无法引发完全活化，因为TCR的聚集和空间组织不足，而这些对于下游信号放大至关重要（Minguet等人，2007年；Dustin，2023年）。因此，相关文献描述了多种方法和抗体剂量，但往往缺乏统一的实验依据，导致活化方案的多样性。此外，科学论坛上的讨论表明，无论是新手还是经验丰富的研究人员，对这些实验的优化和标准化仍有许多疑问。

尽管有共同的原则，但文献中关于剂量、固定形式和测量结果的差异仍然明显，导致结论不一致。鉴于这些实验在细胞治疗（ACT）中的转化相关性日益增加，对活化条件和扩增条件进行全面和比较性的评估对于协调实验设计和优化功能测量结果至关重要（June，2007年；Albrecht等人，2023年）。在T细胞活化/扩增的优化和标准化方面存在诸多挑战（例如培养基的选择（MacPherson等人，2022年），但初始刺激方法仍然是后续所有研究的基石（Li和Kurlander，2010年；Crompton等人，2014年；Soltantoye等人，2022年）。

目前还缺乏对不同T细胞刺激方法的系统比较。为了解决这一不足，我们评估了不同抗体剂量和形式（可溶性、固定在板上的或固定在珠子上的）对小鼠CD4和CD8 T细胞活化的影响。我们还比较了在辅助细胞存在下的活化情况。活化效率通过多参数测量进行评估，包括早期活化标志物（CD25、CD69、CD44）、细胞因子分泌（IL-2、IFN-γ）以及通过CFSE稀释法检测的细胞增殖。这项综合分析旨在确定合适的初始条件，突出每种形式的权衡，并为基础研究和转化研究中的可重复实验设计提供实用指导。

实验部分

小鼠

我们从The Jackson Laboratory（JAX 000664）购买了6至12周大的雌性C57BL/6J小鼠，并将其饲养在无病原体的屏障设施中。所有程序均经过Albert Einstein医学院的机构动物护理和使用委员会的审查和批准，符合公认的人道动物护理标准。

T细胞分离和活化

使用Mojosort Mouse CD4纳米珠（Biolegend；480,070）或CD8小鼠T细胞分离试剂盒（Miltenyi）从脾脏中分离出初级小鼠T细胞

用于验证早期T细胞活化效率的方法

我们根据两个时间点测量的三个关键参数来确定早期T细胞活化效率。活化后24小时，我们通过流式细胞术量化活化标志物（CD25、CD69、CD44）的上调情况，并通过ELISA检测细胞因子分泌情况。72小时后，我们通过流式细胞术检测CFSE稀释法测量的细胞增殖峰值。

为了比较抗体剂量和呈现形式的影响，我们进行了精细的剂量-反应研究，涵盖了文献中发现的各个范围

讨论

在本报告中，我们全面概述了体外实验在初级小鼠T细胞活化应用中的方法。我们的结果明确了在选择不同方法时应考虑的关键因素，并提供了支持这些实验合适条件的实验证据。我们还讨论了实际操作方面，以帮助科学家更有效地在实验室中建立可靠的T细胞活化实验。

在评估T细胞活化时，需要

作者贡献

FG和SP进行了实验、数据分析以及手稿的审阅和编辑。BC参与了实验和数据分析。RH参与了手稿的审阅和编辑。YB提出了研究方案、进行了实验和分析，并撰写了手稿。

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本手稿的过程中，作者使用了ChatGPT和Perplexity工具来审查和校正文本质量，并作为查找出版物的辅助工具。使用这些工具/服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

Floralba Gjergjova：撰写 – 审阅与编辑、方法学、实验设计。Sandra Pelka：撰写 – 审阅与编辑、方法学、实验设计、数据管理。Bhakti Chavda：实验设计、数据分析。Ranee Harrison：撰写 – 审阅与编辑。Yair Botbol：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验监督、软件使用、资源协调、项目管理、方法学设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。

资助

本工作得到了NIH（P01-AG031782）和Albert Einstein医学院的资助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作献给我们敬爱的导师Fernando Macian-Juan博士。Albert Einstein医学院的流式细胞术核心设施提供了资源和建议。该设施部分得到了NCI癌症中心服务资助（P30CA013330）的支持。共享仪器设备资助购买了Cytek Aurora FACS分析仪（S10OD026833-01）。YB感谢Daniel Zamith-Miranda博士在GraphPad Prism软件使用方面的帮助。YB还感谢Benjamin Azancot的帮助。