综述：基于改进型引导RNA的CRISPR-Cas系统性能提升：综述

《Analytica Chimica Acta》：Performance enhancement of CRISPR-Cas system based on improved guide RNA: a review

CRISPR-Cas技术因存在靶向效率低、脱靶效应、灵敏度不足等瓶颈，需通过gRNA优化提升性能。本文系统综述了gRNA结构设计对提高基因编辑效率和生物传感检测能力的作用机制，分析了不同Cas系统（如Cas9、Cas12、Cas13）在gRNA设计上的差异，并探讨了当前技术挑战与未来研究方向。

　　

张小庄|田晨燕|王敏|贾怀宇|李兴荣|田国珍

中国海南省海口市海南妇女儿童医疗中心，邮编571199

摘要

背景

CRISPR-Cas技术作为一种变革性工具，在基因编辑和生物传感研究中得到了广泛应用；然而，它仍面临一系列与性能相关的瓶颈，包括目标定位效率不佳、非目标效应、灵敏度和识别特异性不足、目标范围有限、多重检测能力有限、反应系统不兼容以及稳定性下降等问题。随着gRNA优化成为解决这些瓶颈的核心策略，迫切需要整合这一快速发展的领域中的最新研究成果。现有文献缺乏对gRNA优化如何缓解这些关键限制的全面、系统的分析，以及对当前挑战和未来方向的探讨。

结果

本文综述了通过引导RNA（gRNA）优化提升CRISPR-Cas系统性能的最新进展，并进一步分析了该领域的当前挑战、未来前景和有前景的研究方向。

意义

现在正是指导研究人员克服CRISPR-Cas性能障碍、加速其在基因编辑和生物传感中应用的好时机。

引言

自从发现细菌和古菌能够将来自噬菌体或质粒的特定30-40个碱基对的外源DNA片段整合到CRISPR位点（规律间隔的短回文重复序列）中，从而赋予这些微生物序列特异性的适应性免疫防御机制以来[1]，[2]，[3]，CRISPR-Cas系统已成为分子生物学中不可或缺且有效的工具，广泛应用于各种体内和体外实验研究。它还成为生物医学、临床诊断、环境工程、分析化学、植物科学和农业科学等多个学科的基础技术[4]，[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]。

在过去十年中，CRISPR-Cas技术已经从基础科学发展为转化医学，在基因编辑和生物传感领域取得了深入的研究和应用[11]，[12]。CRISPR基因编辑技术具有许多优势：设计简单（仅需单链引导RNA，而其他技术依赖于蛋白质工程）、成本低廉、建立时间短、分子体积小以及可编程性强。这在很大程度上导致了锌指核酸酶（ZFNs）、巨核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）等基因编辑技术的逐渐边缘化[13]，[14]。此外，CRISPR-Cas技术还具有出色的核酸酶活性（尤其是Type V CRISPR-Cas12系统和Type VI CRISPR-Cas13系统，它们分别能切割特定的单链DNA和单链RNA）、信号放大效应（不会造成污染）以及令人满意的特异性。因此，基于CRISPR的生物传感平台开创了创新的分子级遗传诊断方法，确立了其作为下一代分子诊断平台的地位[15]，[16]，[17]。

在Type II CRISPR-Cas9系统中，功能性gRNA由两个不同的组成部分构成：跨激活crRNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）[18]。在内源表达和成熟过程中，由串联重复序列和独特间隔序列组成的CRISPR阵列被转录成长的前体crRNA（pre-crRNA）。同时，tracrRNA从与CRISPR阵列相邻的独立基因位点转录而来，其序列与pre-crRNA的重复区域具有完美的互补性，从而实现稳定的碱基配对。这种杂交后形成的双链RNA（dsRNA）作为宿主内切酶RNase III的典型底物，在重复-间隔交界处切割pre-crRNA，生成保留完整间隔序列的crRNA。随后，在Cas9和其他辅助核酸酶的作用下进一步成熟为功能性crRNA。crRNA-tracrRNA双链以序列依赖的方式与单个Cas9蛋白结合，形成crRNA-tracrRNA-Cas9效应复合体[19]。尽管这种双RNA系统具有内源性生物学功能，但在体外和实验室应用中仍表现出固有的复杂性和低效率。2012年，一项开创性的研究将crRNA和tracrRNA融合在一起，创建了合成引导RNA（sgRNA）[20]。实验证实，工程化的sgRNA-Cas9系统的DNA切割效率与天然crRNA-tracrRNA-Cas9复合体相当。这一突破标志着gRNA的首次合理设计，促进了CRISPR-Cas9作为主流基因编辑平台的广泛应用，并巩固了其在分子生物学中的变革地位。与Cas9相关的前体crRNA复杂的成熟途径不同，Cas12和Cas13系统的处理过程更为简洁直接。CRISPR位点的前体crRNA转录后，Cas12和Cas13蛋白通过其内在的内切核酸酶活性直接在预定位置切割pre-crRNA，从而无需tracrRNA[21]，[22]。

在基因编辑和生物传感应用中，不同的引导RNA结构在各种CRISPR-Cas系统中发挥相应的功能[表1]。

在CRISPR-Cas9和Cas14系统中，tracrRNA具有三个保守的茎环结构，作为其内在的结构支架，使引导RNA与Cas蛋白稳定结合形成核糖核蛋白（RNP）复合体。同时，crRNA负责准确识别目标序列，从而精确引导RNP复合体定位到目标基因位点，赋予生物传感系统极高的特异性[18]，[23]。在CRISPR-Cas12和Cas13系统中，成熟crRNA的3'端保留一个保守的茎环结构作为内源性结构支架，而间隔区域负责识别和定位[21]，[22]。这种简化的crRNA结构为Cas12和Cas13平台在基础研究和转化生物传感应用中的合理设计和实际实施带来了显著优势。

尽管通过人工设计的sgRNA以及随后发现的crRNA在CRISPR-Cas系统中实现了相当大的简化，但在该技术的转化研究和实际应用中仍存在一些关键挑战。具体来说，gRNA活性不足可能会削弱其与目标的结合强度，从而降低编辑效率[24]。在生物传感应用中，主要瓶颈包括灵敏度不足、与等温扩增反应不兼容、单核苷酸区分能力差、多重检测能力有限、目标范围有限以及反应系统的不稳定性[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]。幸运的是，近年来有许多出色的研究提出了针对这些挑战的灵活有效解决方案，重点关注gRNA的结构工程。然而，许多已发表的综述主要关注crRNA的工程方法，而没有探讨其关键功能作用，或者对CRISPR技术在生物传感中的应用前景进行了片面的解读，忽视了crRNA工程在基因编辑领域的重要作用[31]，[32]，[33]。本文全面概述了阻碍CRISPR-Cas系统在基因编辑和生物传感应用中实用性的当前瓶颈，并进一步阐述了提高基因编辑效率和生物传感性能的gRNA工程策略的机制基础和实际实施方法。

章节摘录

利用优化后的gRNA提高基因编辑效率

CRISPR-Cas介导的哺乳动物基因组工程的出现为在基因组水平上缓解大多数遗传疾病带来了巨大希望。2013年，Cas9-sgRNA系统在人类细胞中的内源性AAVS1位点实现了特异性基因编辑，在293T细胞中的目标效率为10%-25%，在K562细胞中为8%-13%，在诱导多能干细胞（iPSCs）中为2%-4%[24]。这项里程碑式的工作证明了基于CRISPR-Cas9的基因组编辑在人类细胞中的可行性，同时

结论、挑战与展望

CRISPR是一项相对较新的技术，在过去十年中经历了爆炸性增长，并持续保持快速发展的趋势。基于CRISPR-Cas技术的应用研究主要集中在基因编辑和生物传感诊断方面。与传统基因编辑技术相比，CRISPR-Cas系统在设计简单性、操作便捷性和编程灵活性方面具有明显优势。

CRediT作者贡献声明

田晨燕：撰写——原始草稿。张小庄：撰写——原始草稿，概念构思。李兴荣：撰写——审稿与编辑，概念构思。田国珍：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念构思。王敏：验证，概念构思。贾怀宇：数据整理，概念构思

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

本文描述的研究未使用任何数据。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了海南省自然科学基金（825MS179）和海南省临床医疗中心（QWYH202175）的支持。

张小庄毕业于安徽医科大学，目前任职于海南省妇女儿童医疗中心，从事即时检测传感策略的设计和应用研究。