综述：极化发光技术在理解生物分子相互作用中的进展

《Biochemical Society Transactions》：Advances in polarised luminescence approaches to understanding interactions between biomolecules

　　

发光光谱学因其灵敏度和选择性而备受关注。偏振光为发光数据增添了额外的维度，由此产生的技术可提供关于分子结构及其相互作用的信息。本综述概述了稳态荧光技术的原理，包括荧光检测圆二色性（Fluorescence-detected Circular Dichroism, FDCD）、荧光检测线二色性（Fluorescence-detected Linear Dichroism, FDLD）、荧光偏振各向异性（Fluorescence Polarisation Anisotropy, FPA）、圆偏振发光（Circularly Polarised Luminescence, CPL）和线偏振发光（Linearly Polarised Luminescence, LPL），并通过实例说明了这些技术如何用于研究生物分子及其与其他分子的相互作用。

论文主体内容总结

引言

本综述聚焦于测量生物分子发光时结合偏振光所获得的信息。当分子处于电子激发态并通过发射光子释放能量时，会发生发光现象，主要包括荧光和磷orescence。在分析发光信号时，考虑光的偏振可以极大地增强信息量。本文重点讨论了在连续恒定光源照射下，测量样品发射的发光，且入射光或发射光为圆偏振或线偏振时所能实现的研究。具体涉及的稳态荧光技术包括FDCD、FDLD、FPA、CPL和LPL。这些实验具有挑战性，相关文献有限且分散。本综述旨在阐明该领域的关键见解和理论，而非全面的文献回顾。

非偏振光荧光

通常的荧光实验涉及各向同性样品和非偏振光。信号强度取决于发射分子的数量以及通过光子发射（而非无辐射衰变）回到基态的跃迁概率。对于大多数荧光团，荧光是从第一激发态到基态的电偶极跃迁概率。总荧光信号（通常测量为直流信号）是在没有偏振分析的情况下收集的，因此对分子取向和旋转动力学基本不变。在设计荧光实验时，可以选择固定激发波长扫描发射波长（发射光谱），或固定发射波长扫描激发波长（激发光谱）。除非分子在激发后改变几何结构，否则激发光谱会模拟吸收光谱，每个跃迁的强度按其量子产率缩放。

荧光偏振各向异性

FPA是衡量激发和发射之间分子取向保留程度的指标。当分子因布朗运动而快速旋转时，FPA接近于零。FPA非常适合测量小分子与大分子（如蛋白质或DNA）的结合，因为小荧光团在结合到大分子上时，其FPA会显著增加。FPA实验通常在标准的90°荧光计中进行，需要改变激发和发射光束中的偏振器方向来计算公式。虽然一些仪器可自动测量FPA，但通常仅限于单一波长。要测量完整的频率分辨FPA光谱，则需要多个数据点。FPA已被用于研究荧光配体与蛋白质（如牛血清白蛋白）的结合、蛋白酶和激酶，以及跟踪阿尔茨海默病Aβ_1-42淀粉样原纤维形成的动力学。FPA的替代定义是使用所谓的“偏振”，在仪器配置确保G因子为1的情况下，通过在线偏振发光仪器中插入偏振器，可以直接测量波长扫描的FPA^LPL信号。除了配体结合，FPA还可用于帮助指认跃迁的偏振方向，通过激发到更高激发态并测量从第一激发态的发射，利用激发和发射跃迁偶极矩之间的夹角χ来计算FPA或FPA^LPL。

荧光检测圆二色性和荧光检测线二色性

FDCD和FDLD涉及扫描激发波长，交替使用不同偏振的光，并收集每种偏振下发射的光子。FDCD和FDLD通常需要在CD/LD仪器中插入合适的长通滤光片，以阻挡入射光同时允许更长波长的发射光子通过。FDCD、FDLD强度作为激发波长的函数，与荧光团的吸收、CD或LD以及每个吸收跃迁的量子产率Φ的乘积成正比。与吸收光谱法不同，荧光检测光谱法可以分离出荧光团的光谱，避免大多数散射伪影，并且通常会增强最低能量波段。其主要缺点是截止滤光片在标称波长附近不完美，且通常信噪比较低。使用同步辐射光源可以显著改善FD实验，因为它在真空紫外区域提供了高出数个数量级的光子通量。

圆偏振发光

CPL（以及LPL）的仪器设置与FDCD（和FDLD）相反，使用非偏振光激发样品，并在发射路径中使用光弹性调制器，以实现对发射偏振态的差分检测。CPL与总发射的比值称为不对称因子。在解释报告值时，光谱学家需要检查是否包含2ln(10)和32980等因子以及仪器软件使用的符号约定。与CD类似，CPL信号较弱，因为它依赖于磁偶极跃迁矩。样品和/或光路中的线性和圆形双折射会在传播过程中转换偏振态，并对测量的光谱产生伪影。然而，180°检测几何结构和去偏振激发可以最小化此类伪影。定向样品会为CD和CPL带来显著的线性贡献。在同一样品、同一仪器上配对测量CD和CPL是有用的，但大多数商业仪器无法实现。尽管如此，该技术的潜力已通过一些实例得以说明。

本征蛋白质CPL

本征蛋白质荧光有广泛的应用，但蛋白质CPL的例子很少。Gussakovsky等人报道了用CPL探测蛋白质结构、功能和折叠。他们仅报告了g^CPL，有时包括荧光光谱。本综述展示了十五肽短杆菌肽中三个色氨酸的CPL测量结果，其不对称因子与CD光谱的长波长波段相似。绿色荧光蛋白的强本征荧光团埋藏在β-桶中。Goto等人测量了GFP的正CPL信号。他们的长波长g^CD小一个数量级，这与激发态去质子化增强发射一致。

外源蛋白质CPL

大多数蛋白质CPL报告涉及通过配位、共价合成或非共价相互作用与肽或蛋白质结构结合的高效荧光团。配位主要是镧系元素络合物。Rybicka等人测量了非手性硫代黄素T与非共价结合到两种形式的胰岛素淀粉样纤维所产生的CPL。两种形式在长波长产生正或负的ThT CD信号，并匹配短波长CPL信号。淀粉样纤维的手性光学反转可能具有生物学意义，这促使Li等人探索ThT CPL反转。Deng等人创建了自组装的螺旋纤维，其结合ThT并产生了CPL信号。

核酸染料CPL

使用CPL研究DNA相关荧光团的首次报道可能在2017年。他们检测到与入射光成90°的信号，并注意到伪影。使用180°配置，后续研究表明CPL可以揭示DAPI在不同化学计量下DNA结合模式的变化。Jiang等人表明，富含AT的双链DNA可诱导非手性咔唑基双花青荧光团产生CPL，这些荧光团结合在DNA的小沟中。右旋和左旋双链DNA分别产生正和负的CPL信号。通过调节pH形成其他DNA结构（如三链体），CPL会关闭。Chen等人表明，ThT CPL的强度、符号和波长的变化可用于跟踪平行和反平行以及左旋和右旋DNA G-四链体结构的形成。目前尚未有使用核酸染料CPL研究RNA系统的报告。

氨基酸-镧系元素和蛋白质-镧系元素系统的CPL

许多已发表的CPL数据涉及镧系元素，因为它们的发射态从基态是电偶极禁阻的，但许多是磁偶极允许的，从而产生更大的不对称因子。本征Ln³⁺吸收较弱，实验通常激发一个“天线”配体波段，将能量转移到磁偶极允许的状态。然后在f→f跃迁处观察到发光。Brittain和Richardson在1977年报道了Ln-氨基酸CPL，旨在使用镧系元素作为钙的替代物来探测蛋白质中的Ca²⁺结合。De Jersey等人在1981年观察到，在pH 6.6附近滴定蛋白质时，545 nm Tb³⁺发射增强，表明氨基酸足够近，可以作为天线。?oruh和Riehl测量了Tb³⁺与胰蛋白酶、钙调蛋白和小清蛋白结合的CPL。胰蛋白酶在⁵D₄→⁷F₅跃迁处显示出明显的线形，而EF-hand蛋白质钙调蛋白和小清蛋白共享一个双信号耦合峰，表明配位环境相似。氨基酸镧系元素络合物也可以通过激发进入Ln³⁺LMCT波段来增强其他分子的CPL，该波段获得了手性环境。Okutani等人使用强发光的非手性配合物，在精氨酸和组氨酸存在下显示红色⁵D₀→⁷F_0-4跃迁，实现了氨基酸的手性感测。Krupová等人使用拉曼光学活性仪器测量了在谷氨酸对映体和溶菌酶原纤维存在下，EuCl₃和Na₃[Eu(DPA)₃]在580-600 nm之间诱导的CPL。

镧系元素与其他生物分子的CPL

Shuvaev等人研究了非手性双金属[EuL]Zn²⁺在ADP和ATP存在下的CPL，发现在335 nm激发和570 nm以上检测时，Eu的⁵D₀→⁷F₄波段具有相反的手性。核苷酸通过磷酸盐结合，取代了Eu与Zn之间的水桥。Wu, Bou?和Andrushchenko使用ROA仪器测量了dGMP-Eu³⁺和DNA-Eu³⁺配合物的CPL光谱，观察到对pH、DNA结构和结合化学计量的依赖性。Nakamura等人说明了铕金属配合物如何在表面活性剂膜中与DNA杂交，产生高荧光和CPL。Wu等人使用上述ROA方法获得了不同糖类在EuCl₃、NaEu(EDTA)和Na₂Eu(二亚乙基三胺五乙酸)存在下的不同特征信号。

线偏振发光

与CPL类似，LPL使用非偏振光激发，并测量水平和垂直偏振发射之间的差异。LPL的不对称因子取决于分子的取向参数。LPL的信噪比远优于CPL，但需要样品取向。在最简单的层面上，LPL反映了LD的信息。g^LD= g^LPL适用于孤立的最低能量吸收带，且在发射前激发态没有几何变化。光谱学家应检查是否包含2ln(10)因子以及软件使用的符号约定。LPL信号清晰地显示了DAPI在DNA上随负载量变化的结合模式变化。与CPL一样，双折射伪影可以通过180°检测和使用去偏振入射光来最小化。

总结与结论

极化发光光谱学为荧光测量提供了额外的维度，揭示了生物分子的结构、取向、手性和动力学。FPA通过监测旋转迁移率来区分结合与未结合的荧光团，且不受非发射物种的干扰。FDCD和FDLD从背景中分离出荧光团的吸收光谱，揭示了标准吸收测量中被掩盖的结构细节。CPL探测荧光团环境的手性，并可为镧系元素发光系统提供大的不对称因子，这对于表征结合环境具有重要价值。LPL以优于CPL的信噪比提供相对取向信息，但需要样品排列。尽管本文未讨论极化光谱学如何增强激子耦合、F?rster共振能量转移或猝灭实验，但预计它们将为获取的数据增加额外维度，从而有助于支持分析，例如蛋白质中的多个色氨酸。由于LPL需要通过样品排列或结合到手性/定向的生物分子环境来定向荧光团，因此它包含了各向同性发光测量中不存在的局部三维几何信息。然而，该领域仍缺乏使CD光谱学等被广泛采用的简单解释启发法。系统研究何时每种技术能提供独特的结构信息，将加速其超越专业实验室的采用。对于生物分子系统，最大的机会在于利用这些技术的无背景特性，研究其他方法无法应对的复杂混合物中的结合和折叠。更广泛的采用还需要改进对仪器的使用，特别是目前仅在少数商业仪器上可用的波长扫描CPL和LPL测量。

展望

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  极化发光光谱学揭示了各向同性荧光无法看到的生物分子相互作用，并消除了困扰常规方法的非发射背景干扰。这些技术使得能够定量分析复杂生物混合物中的结合模式、取向和比例。
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  FPA通过复合物迁移率的变化监测结合事件，而荧光检测的圆二色性和线二色性则将荧光团的吸收光谱从复杂背景中分离出来。CPL提供手性环境的灵敏测量，而LPL直接报告分子取向。
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  极化发光光谱学的未来取决于仪器的改进和稳健解释框架的发展。更广泛的采用将需要能够进行波长扫描CPL和LPL测量的商业仪器，以及建立极化发光光谱解释原则的系统研究。