基于酶级分子模拟的功能细菌辅助筛选方法，用于快速实现生物电化学传感

《Bioresource Technology》：Enzyme-Level Molecular Simulation-Assisted Screening of Functional Bacteria for Rapid Bioelectrochemical Sensing

本研究提出结合分子动力学模拟与分子对接的集成框架，用于检测高电子活性微生物。通过模拟己糖激酶与葡萄糖的稳定结合及构象变化，优化电子生成与传递机制。实验表明，传感器响应时间缩短至10分钟，检测范围为73.3-440.0 mg/L，相关系数R2=0.987，验证了该策略在实时BOD监测中的应用价值。

　　

张子阳|刘金辉|吴万青|牛佳琪|郭萍|程静|陈青

大连海事大学海洋工程学院，中国大连116026

摘要

生化需氧量（BOD）是水环境中有机污染的关键指标，其快速准确的测定对于监测和控制水质至关重要。基于微生物燃料电池的BOD传感技术受到了越来越多的关注；然而，微生物的有限电子传递能力限制了传感器的响应速度。本研究提出了一个结合分子动力学（MD）模拟和分子对接的集成框架，用于检测高电活性微生物。己糖激酶通过与葡萄糖的氢键和碳-氢键形成稳定的复合物。在模拟过程中，这些复合物表现出稳定的构象变化，并显示出最佳的亲和力和结合能力。进一步分析了电子生成和传递的机制及其电化学性能。实施该策略并进行实验后，结果显示传感器的响应时间缩短至10分钟，比之前的测量结果提高了50%。检测范围确定为73.3–440.0 mg/L。此外，BOD浓度与实际性能之间存在强相关性（R² = 0.987），这充分证明了传感器对BOD检测的快速响应性和高准确性。这项工作加速了传感器的响应速度，并引入了一种新的酶级MD模拟框架，以优化菌株选择，为实时BOD监测提供了有效策略。

引言

生化需氧量（BOD）是评估有机环境及生态系统健康状况的常用指标（Jouanneau等人，2014年）。过量的有机物通过微生物代谢消耗溶解氧，危及水生生物并破坏生态平衡。传统的五天生化需氧量（BOD₅）测定方法通过微生物耗氧量来量化可生物降解的有机物；然而，其较长的测试周期阻碍了快速响应和实时监测。为了克服这一限制，最近将微生物燃料电池（MFC）应用于BOD的检测，该技术能够将有机底物的变化直接转化为电信号，从而实现快速稳定的测量（Du等人，2007年）。

尽管基于MFC的传感器显著缩短了BOD检测时间，但其响应时间通常仍约为20小时，这限制了其实际应用（Wang等人，2019年）。作为多功能的生物电化学平台，MFC广泛应用于废水处理、毒性监测和污染物检测，在BOD传感领域具有特别的前景（Navidjouy等人，2023年）。然而，现有研究主要集中在设备设计和操作优化上，对影响性能的关键生物机制关注较少。实际上，传感器的性能在很大程度上取决于电活性微生物（EAM）的电子传递能力（Hou等人，2011年）。因此，分离和筛选具有快速环境响应性的EAM菌株成为提高MFC传感器性能的关键策略。以往的研究采用了24孔空气阴极MFC阵列系统作为高通量和敏感的微生物筛选平台（Choi等人，2015年）。但这些方法依赖于微生物培养和富集，使得结果容易受到培养条件的影响。另一种方法是利用基因工程增强电子传递能力和电极粘附性，从而提高功率输出和稳定性（Simoska等人，2023年），但这些方法复杂且成本较高，效率和质量稳定性有限。相比之下，酶级预筛选作为一种分子尺度的计算策略，能够高效精确地识别具有优异电子传递能力的微生物，克服了传统方法的局限性，为菌株优化提供了更简单、更可靠的方法。

中心碳代谢对微生物能量产生、碳源代谢以及关键中间体的合成至关重要（Zaganjor等人，2017年）。在MFC中，电子是通过微生物对有机底物的代谢分解产生的。糖酵解、三羧酸循环和电子传递链是这一过程的关键组成部分（Ambrosini等人，2020年）。糖酵解作为葡萄糖和其他可溶性有机底物进入中心代谢网络的主要途径，对底物转化为代谢中间体的效率有显著影响。通过调节代谢流，糖酵解影响还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的生成（John等人，2024年），而NADH是微生物呼吸代谢中的关键电子供体。NADH的细胞内可用性决定了电子的流动，进而影响微生物在电极表面的电子释放（Li等人，2018年）。在快速响应传感器应用中，底物摄取和代谢处理的速率决定了早期电子传递，并影响电流信号的上升（Choi等人，2014年）。因此，优化糖酵解可以提升传感器的响应时间。己糖激酶是糖酵解中的关键酶，它催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，从而启动糖酵解过程。酶在底物结合和催化方面的效率直接影响葡萄糖的激活及下游代谢过程，促进NADH的快速积累并加速电子传递（Feng等人，2023年）。由于葡萄糖激酶亲和力低或催化速率慢导致的启动延迟会导致传感器响应滞后（Matschinsky和Wilson，2019年）。因此，优化葡萄糖激酶与其底物之间的分子相互作用是筛选具有优异结合和催化特性的菌株的合理策略。

本研究开发了一种基于分子动力学（MD）的策略，用于筛选和优化EAM，并通过实验验证和MFC传感器的设计来实现快速BOD检测。根据以往的研究，选择Burkholderia cepacia和Shewanella putrefaciens作为代表性菌株。对这两种菌株的己糖激酶-葡萄糖复合物进行了分子对接初步评估，随后通过MD模拟评估了结合稳定性，并阐明了电子生成和传递的机制。选定的菌株被固定在电极上，通过电化学方法表征了它们的电子传递行为，并在MFC系统中评估了它们的响应时间。优化后的系统响应时间减少了50%。值得注意的是，本研究引入了一种以糖酵解为中心的酶级筛选策略，通过针对早期代谢步骤来增强电子传递，从而快速识别高效电活性菌群，并为MFC传感器的菌株选择提供了合理依据。

试剂

试剂的详细信息见补充材料（S1节）。

材料制备

阳极材料（Fe₃O₄/Fe₂O₃/CNT/PANI@CF）的制备方法见补充材料（S2节）。

MD模拟

从B. cepacia（A0A0H3KGM5）和S. putrefaciens（A0A9E6BAL0）中提取的己糖激酶的氨基酸序列来自UniProtKB。蛋白质结构通过SWISS-MODEL进行同源建模生成，并使用Global Model进行评估

电活性微生物的筛选及相互作用分析

电活性微生物（EAM）的筛选和相互作用分析借鉴了以往关于产电微生物的研究，并结合分子对接进行菌株选择。Acidovorax、Desulfovibrio、Geobacter和Shewanella等属的微生物已被报道具有强电活性，其中Shewanella在复杂条件下表现出更强的稳定性（Nong等人，2024年）。作为代表性菌株，S. putrefaciens表现出典型的己糖激酶活性和电化学行为

结论

本研究结合分子对接、MD模拟和实验验证，识别出主要的电活性细菌。多项MD指标表明，S. putrefaciens中的己糖激酶具有高亲和力结合葡萄糖，并在构象上保持稳定。电化学分析进一步揭示了其优异的电子生成和传递性能，这可能与黄素类化合物和内源性介质有关，体现在其对某些因素的较低抗性上

CRediT作者贡献声明

张子阳：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，数据管理。刘金辉：指导，研究。吴万青：指导，资金获取，正式分析，概念构思。牛佳琪：研究，数据管理。郭萍：数据管理。程静：研究。陈青：研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢国家自然科学基金（项目编号52271358、51879025）的财政支持。