《Cell Insight》：FINE-EM-seq: a rapid isothermal amplification method enabling comprehensive methylome profiling of zebrafish early embryos
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针对现有甲基化测序方法（如PCR扩增）存在的覆盖度不均、甲基化定量偏差、材料损耗大和流程繁琐等问题，研究人员开发了一种名为FINE（基于切口酶的快速等温扩增）的创新等温扩增策略，并将其与酶转化测序（EM-seq）结合，形成FINE-EM-seq方法。该方法可在20分钟内对亚纳克级输入的甲基化文库进行高效扩增，有效减少扩增偏好性，提高覆盖均匀性和甲基化检测准确性。通过应用于斑马鱼四个早期发育阶段，成功表征了与囊胚形成和原肠胚早期相关的甲基化动态变化，并揭示了之前因覆盖不足而被忽视的、富集于AT-rich区域的差异甲基化区域（DMRs）。这项工作为发育生物学和临床表观基因组学中的低输入全基因组甲基化测序提供了一种快速、稳健的解决方案。
在生命孕育的最初时刻，除了基因序列本身，细胞还携带着另一套被称为“表观遗传”的调控密码，其中DNA甲基化扮演着核心角色，它像一串分子“开关”，调控着哪些基因在何时、何地被开启或关闭，深刻影响着胚胎发育、细胞分化乃至疾病发生。长期以来，绘制高精度、全基因组的甲基化“地图”一直是科学家们追求的目标。金标准方法——亚硫酸氢盐测序虽然精度高，但其剧烈的化学处理会严重损伤DNA，导致珍贵的样本材料大量丢失。近年来，以酶转化测序（EM-seq）为代表的、更温和的非亚硫酸氢盐方法应运而生，减轻了DNA损伤，但它们通常仍依赖聚合酶链式反应（PCR）来扩增测序文库。问题在于，PCR本身就是一个不完美的“放大镜”：它存在“偏袒”效应，倾向于扩增某些特定序列（如GC含量不均衡的区域）和未发生化学转化的DNA片段，导致最终测得的基因组覆盖度不均，甲基化水平的定量发生扭曲，尤其是在样本量极为有限的场景下（如早期胚胎、微量临床样本），这种技术偏差会严重干扰我们对真实生物信号的理解。此外，依赖热循环的PCR还可能引发热诱导的DNA损伤和胞嘧啶脱氨基等副反应，进一步影响数据准确性。尽管也有一些基于体外转录（IVT）的等温扩增策略在保真度上优于PCR，但其多步骤、耗时长（常需过夜孵育）的流程限制了其在时效性要求高或高通量环境中的应用。因此，开发一种能够兼顾高保真度、高通量适用性、流程简便且兼容经转化DNA的扩增技术，成为低输入甲基化组学研究领域亟待突破的瓶颈。
针对这一挑战，由武汉大学中南医院等机构的研究人员在《Cell Insight》期刊上发表了一项研究。他们巧妙地绕开了热循环，开发出一种名为FINE（Fast Isothermal amplification via Nicking Enzyme，基于切口酶的快速等温扩增）的等温扩增新策略，并将其与酶转化测序结合，创建了FINE-EM-seq工作流程。该技术的核心在于利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶与一种位点特异性的切口酶“联合作战”，在恒定温度下仅需20分钟即可实现指数级扩增。研究者们证明，与传统的PCR方法相比，FINE-EM-seq在文库效率、覆盖均匀性、GC偏好性以及甲基化检测准确性方面均表现出显著优势。更重要的是，他们成功地将该技术应用于仅1纳克输入的斑马鱼早期胚胎DNA，对四个关键发育阶段（64-细胞期、128-细胞期、1k-细胞期和胚环期）的甲基化组进行了高保真度分析，不仅刻画了伴随囊胚形成和早期原肠胚发生的阶段特异性甲基化动态变化，还“照亮”了之前由于PCR偏好性而覆盖不足的AT-rich基因组区域，在其中发现了大量具有潜在调控功能的差异甲基化区域。这项工作为在微量甚至痕量样本中进行准确、快速的表观基因组研究开辟了新途径。
为开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术：首先，开发并优化了FINE等温扩增体系，利用Bsu DNA聚合酶和Nt.BsmAI切口酶在恒温条件下实现文库扩增。其次，采用酶转化测序（EM-seq）技术对DNA样本进行甲基化转化处理。接着，利用斑马鱼胚胎（四个早期发育阶段）作为模型样本，制备了低输入量的甲基化测序文库。最后，通过高通量测序（Illumina NovaSeq平台）和生物信息学分析（包括比对、甲基化水平计算、差异甲基化区域DMR鉴定、GC偏好性分析、基因富集分析等），全面评估了FINE-EM-seq的技术性能及其在生物学研究中的应用价值。
研究结果
FINE系统的开发
研究人员筛选了多种等温扩增策略，最终基于切口酶辅助扩增（NEAA）原理，优化开发出FINE系统。该系统通过使用高特异性的Bsu DNA聚合酶、添加T4 gp32单链结合蛋白和PEG8000，实现了在恒温（34°C）下20分钟内对带标准Y型接头的DNA片段库进行高效、特异的指数扩增。初步验证显示，FINE扩增的文库在片段大小分布、碱基质量分数和比对率方面与PCR及高输入PCR-free（无PCR扩增）文库质量相当。值得注意的是，在未经转化的全基因组测序（WGS）应用中，FINE会在其切口酶Nt.BsmAI的识别位点（GTCTC）附近产生局部覆盖度下降，但在经过C-to-T转化的甲基化测序中，由于大部分识别位点被破坏，该序列依赖性偏差基本被规避，因此FINE特别适用于转化后的甲基化测序文库扩增。
FINE在EM-seq文库扩增中表现优于PCR
研究者在不同输入量（1 ng, 100 pg, 10 pg）下，使用转化后的HeLa细胞基因组DNA，对FINE-EM-seq和PCR-EM-seq进行了系统性比较。结果显示，FINE展现出更优的性能和鲁棒性。首先，FINE在低至10皮克的输入下仍能保持约80%的稳定比对效率，而PCR方法的比对效率随输入量降低而下降。其次，FINE扩增的文库插入片段大小分布更稳定，且在低GC含量区域能保持相对更好的覆盖均匀性，减少了PCR固有的GC偏好性影响。此外，通过使用非甲基化和完全甲基化的掺入对照进行评估，FINE文库显示出比PCR文库更低的假阳性（未转化率）和假阴性（错误转化率）错误率。这表明FINE能有效减少PCR倾向于扩增未转化片段以及热循环可能引起的修饰胞嘧啶脱氨基所导致的偏差。这些改进并非完全归因于聚合酶的选择，而是FINE等温扩增机制本身带来的优势。
FINE-EM-seq实现对斑马鱼早期发育的高保真甲基化组图谱绘制
为评估FINE-EM-seq在真实生物样本中的应用潜力，研究人员将其应用于斑马鱼四个早期发育阶段（64-细胞、128-细胞、1k-细胞、胚环期）的胚胎，每个样本仅使用1纳克DNA。FINE-EM-seq成功绘制了这些阶段的甲基化组图谱，结果显示全局CpG甲基化水平在发育过程中保持稳定，仅有轻微上升。与相同样本、相同测序深度的PCR-EM-seq相比，FINE-EM-seq文库显示出更高的文库复杂度（重复率更低、有效覆盖更广）。与已发表的斑马鱼全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）参考数据集相比，FINE-EM-seq在多数阶段覆盖了更多的CpG位点，并且观察到的阶段特异性甲基化模式与已知的发育动态一致。例如，在调控体轴发育的hoxb基因簇区域，FINE-EM-seq显示了均匀的覆盖和一致的重复性。差异甲基化分析在成对阶段比较中鉴定出大量低甲基化区域（hypo-DMRs）。基因本体（GO）富集分析显示，这些DMRs关联的基因显著富集于GTP代谢过程、钙依赖性细胞间粘附、神经发生等与早期胚胎发育密切相关的生物学过程。研究还发现了位于dync1li1（细胞质动力蛋白复合体成分）和sox19a（SoxB1转录因子，参与合子基因组激活ZGA）等关键基因附近的hypo-DMRs，这些变化与基因的功能和表达调控时机相符。
FINE-EM-seq的均匀覆盖度提升了AT-rich区域DMRs的检测能力
斑马鱼基因组中有超过10%的区域是AT-rich（GC含量<25%），但这些区域在已发表的WGBS数据中代表性不足。FINE-EM-seq凭借其更均匀的GC覆盖，显著改善了对AT-rich区域的覆盖。分析发现，在鉴定出的所有hypo-DMRs中，平均有34.6%包含至少一个AT-rich的100-bp区间。对于位于这些AT-rich区域的DMR相关CpG位点，FINE-EM-seq的平均覆盖度（3.74–4.69×）显著高于WGBS数据集（0.21–3.40×）。一个典型的例子是acvr1l (alk8)基因（一种BMP I型受体，对斑马鱼背腹图式形成至关重要）启动子区域的一个hypo-DMR，该区域富含AT，且其中关键CpG位点的甲基化水平在发育过程中发生变化。FINE-EM-seq在该位点获得了可靠的覆盖度（>3×），而WGBS数据覆盖有限。这证明FINE-EM-seq能够揭示以往因技术偏差而被掩盖的、位于AT-rich区域的发育调控相关表观遗传变化。
研究结论与讨论
本研究开发的FINE是一种快速（20分钟）、低偏好的等温扩增方法，能够从亚纳克级输入中生成高质量的甲基化测序文库。它通过用恒温、酶驱动的扩增替代PCR，简化了文库制备流程，减少了扩增偏差和材料损失。FINE-EM-seq在斑马鱼早期胚胎研究中的成功应用，证明了其在解析复杂生物学过程（如发育中的微妙表观遗传重编程）方面的强大能力。该方法不仅使用的胚胎数量更少、所需测序深度更低，而且产生的数据集在GC含量覆盖上更均匀，从而能够更完整、更准确地揭示之前代表性不足的基因组区域（特别是AT-rich区域）中的甲基化动态。
当然，FINE也存在一定局限性。例如，其依赖的Nt.BsmAI识别位点（GTCTC）可能导致其在非转化的全基因组测序等应用中产生局部覆盖偏差。此外，作为一个指数扩增过程，在皮克级别的极低输入下，其性能仍会有所下降。
展望未来，FINE在速度、简便性和准确性方面的优势为其技术优化和更广泛的应用提供了广阔前景。一个关键方向是将其灵敏度推向真正的单细胞水平。此外，其温和的低温化学特性使其非常适合处理循环游离DNA（cfDNA）、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、古DNA等具有挑战性的样本类型。恒温操作形式也便于自动化和在即时检测（point-of-care）场景中应用。随着持续发展，FINE有望成为一种多功能的平台型技术，赋能低输入表观基因组学研究，并在广泛的研究和临床环境中实现快速、经济的甲基化图谱分析。
