《PLOS Pathogens》：In silico design of a novel multi-epitope mRNA vaccine candidate for BtHKU5-CoV-2 using immunoinformatics
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为了应对新发现的蝙蝠源性冠状病毒BtHKU5-CoV-2潜在的人际传播风险，研究人员利用免疫信息学方法，从病毒刺突糖蛋白中筛选出细胞毒性T细胞、辅助T细胞和B细胞表位，构建了多表位mRNA疫苗候选分子。计算分析显示该疫苗具有较好的预测抗原性、免疫原性和安全性，并能与Toll样受体（TLR）结合，模拟免疫应答可诱导细胞与体液免疫。该研究为防范未来可能爆发的BtHKU5-CoV-2疫情提供了快速、经济的疫苗设计策略。
在冠状病毒不断演化的背景下，新出现的蝙蝠源性病毒BtHKU5-CoV-2因其能够利用人类ACE2受体感染人体细胞而引起了科学界的警惕。该病毒与导致SARS和COVID-19大流行的SARS-CoV-1、SARS-CoV-2使用相同的功能受体，且具有广泛的宿主趋向性，预示着其存在向人类溢出的高风险。尽管尚无人类感染病例报道，但提前开发有效的预防性疫苗对于防范潜在的全球性疫情暴发具有紧迫的战略意义。传统的疫苗研发周期长、成本高，难以应对突发性新发传染病。随着mRNA疫苗技术在抗击COVID-19疫情中取得成功，其快速、灵活、高效的生产优势为应对新发病毒威胁提供了新的解决方案。与此同时，免疫信息学方法的进步使得研究人员能够高效地从病毒蛋白中筛选出具有免疫原性的保守表位，从而设计出能够同时激发细胞免疫和体液免疫的多表位疫苗。本研究正是基于这一背景，旨在通过计算机辅助设计，为BtHKU5-CoV-2开发一种安全、有效的多表位mRNA疫苗候选分子，以期在疫情真正暴发前做好技术储备。该研究成果已发表在《PLOS Pathogens》期刊上。
研究人员开展此项研究主要运用了以下关键方法：首先，从公开数据库获取BtHKU5-CoV-2不同毒株的刺突糖蛋白序列，并选择代表性毒株进行后续分析。其次，利用NetCTL、NetMHCIIpan、ABCpred等一系列生物信息学工具预测并筛选细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和线性B淋巴细胞（LBL）表位，并评估其抗原性、免疫原性、毒性和致敏性。接着，通过同源性分析和保守性分析确保所选表位在不同毒株间保守且与人类及肠道菌群蛋白无显著同源性。然后，使用特定的连接子（AAY、GPGPG、KK等）将筛选出的表位与免疫佐剂β-防御素II和穿膜肽TAT连接，构建出多表位疫苗的氨基酸序列，并预测其理化性质和三维结构。最后，通过分子对接模拟疫苗与Toll样受体（TLR2、TLR4）的相互作用，利用C-IMMSIM服务器进行免疫模拟，并构建完整的mRNA疫苗序列（包括5‘-UTR、3’-UTR、poly(A)尾等元件），预测其与内体TLR（TLR3、TLR7、TLR8）的相互作用。
1. 表位预测
研究人员从BtHKU5-CoV-2-441毒株的刺突糖蛋白中，通过计算机预测筛选出8个CTL表位、7个HTL表位和5个LBL表位。所有表位均被预测具有良好的抗原性，且无毒、无致敏性。HTL表位还被预测具有诱导IFN-γ、IL-2和IL-4的潜力。保守性分析表明，这些表位在六个BtHKU5-CoV-2毒株中高度保守，提示设计的疫苗可能对多种毒株具有理论上的覆盖广度。
2. 疫苗构建与理化性质预测
将筛选出的表位通过特定连接子连接，并在N端加入β-防御素II佐剂，C端加入TAT穿膜肽，构建了由419个氨基酸组成的多表位疫苗。预测显示该疫苗分子量约为44.37 kDa，抗原性评分较高（VaxiJen 2.0评分0.7537），且预测无毒、无致敏性。理论等电点为9.56，不稳定指数为25.81，预测在体外具有较好的稳定性与高溶解性，适合体内表达。
3. 二级和三级结构预测
二级结构预测显示疫苗蛋白包含25.5%的延伸链、31%的α螺旋和43.4%的无规卷曲。利用Robetta服务器建模并优化后得到疫苗的三级结构模型。通过拉曼图（Ramachandran plot）评估，90.1%的残基位于最优区域，Z-score为-7.54，ERRAT整体质量评分为93.052，这些指标表明优化后的三级结构模型具有合理的构象质量。
4. 构象性B细胞表位预测
利用ElliPro服务器从疫苗的三级结构中预测出4个位于蛋白表面的构象性B细胞表位，得分在0.56至0.821之间，表明疫苗存在潜在的抗体识别位点，可能诱导B细胞介导的体液免疫应答。
5. 分子对接
分子对接研究表明，疫苗构建体与模式识别受体TLR2和TLR4存在潜在的相互作用。疫苗与TLR2预测可形成6个氢键、1个盐桥和118个非键合接触；与TLR4预测可形成22个氢键、2个盐桥和263个非键合接触。分子动力学模拟表明两个复合物具有有限的预测柔韧性和合理的内部残基动态耦合关系，支持其相互作用的结构合理性。
6. 人群覆盖率计算
利用IEDB数据库计算显示，该疫苗设计在全球范围内预测可覆盖约97.49%的人群。在欧洲、北美、美国、法国、俄罗斯等地覆盖率极高（>99%），但在南非和美洲中部地区覆盖率相对较低（分别为51.86%和23.88%），这主要与当地人群HLA（人类白细胞抗原）等位基因分布频率差异有关。
7. 计算机免疫模拟
通过C-IMMSIM服务器模拟接种三剂疫苗后的免疫反应。模拟结果显示，接种后抗体（IgM、IgG）水平显著升高，B细胞、浆细胞、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）数量增加，记忆B细胞和记忆T细胞生成，表明疫苗有潜力激发强大而持久的体液免疫和细胞免疫应答。
8. mRNA疫苗构建
在疫苗序列的N端和C端分别加入组织纤溶酶原激活物信号肽和MHC I靶向结构域后，进行密码子优化，获得适于在人细胞中高效表达的cDNA序列。优化后的序列密码子适应指数为0.91，GC含量61%，预测表达潜力高。构建的全长mRNA序列预测能与内体TLR（TLR3、TLR7、TLR8）结合，分子对接分析进一步支持了这种相互作用的可能性。最后，将优化后的DNA序列克隆至pET-28a(+)载体，为体外转录合成mRNA疫苗提供了模板。
研究结论与讨论
本研究通过免疫信息学方法，成功设计出一种针对新型蝙蝠冠状病毒BtHKU5-CoV-2的多表位mRNA疫苗候选分子。该疫苗基于病毒刺突糖蛋白的保守区域，整合了可激发CTL、HTL和B细胞免疫应答的表位，并加入了β-防御素II佐剂和TAT穿膜肽以增强免疫原性和细胞递送。全面的计算机分析预测该疫苗具有良好的抗原性、免疫原性、安全性和稳定性。其三级结构模型合理，并预测能与关键的天然免疫受体TLR2、TLR4以及内体TLR3、TLR7、TLR8相互作用。人群覆盖率预测和免疫模拟结果均表明，该疫苗有潜力在全球大部分人群中诱发强大的体液和细胞免疫应答。
该研究的重要意义在于，在BtHKU5-CoV-2实际引发疫情之前，提供了一种快速、经济的疫苗设计策略和候选分子，体现了“防患于未然”的主动防范思想。它结合了先进的mRNA疫苗平台和高效的免疫信息学筛选方法，为应对未来可能出现的冠状病毒新发传染病提供了技术储备和快速响应模板。然而，作者也明确指出，所有计算预测结果均为假设生成性质，不能替代实验验证。本研究的局限性包括预测工具本身的算法偏差、对 underrepresented HLA等位基因预测准确性的限制，以及缺乏实验证据证实表位呈递、受体激活、免疫原性和保护效力。未来需要在HLA免疫肽组学、TLR报告基因检测、细胞因子分析、动物模型免疫及攻毒实验等多个层面进行实验验证。尽管mRNA疫苗在递送系统、稳定性和安全性方面仍面临挑战，但其在快速应对新发传染病方面的巨大潜力毋庸置疑。这项计算机辅助的疫苗设计研究，为构建针对潜在人畜共患病毒的疫苗储备库迈出了重要的第一步。
