腹腔镜递送MnO2-P-ICG贴片用于肝细胞癌的光动力治疗与自然杀伤细胞驱动的免疫治疗

《Advanced Science》：Laparoscopic Delivery of a MnO2-P-ICG Patch for Photodynamic Therapy and NK Cell-Driven Immunotherapy in Hepatocellular Carcinoma

肝细胞癌（HCC）复发和转移主要由免疫抑制的肿瘤微环境驱动。为解决此难题，研究人员开展了关于多功能柔性贴片（MnO2-P-ICG NFs）的主题研究。该贴片通过腹腔镜系统共递送吲哚菁绿（ICG）和茯苓多糖（P），实现了近红外光照射下的光动力治疗（PDT）和NK细胞驱动的免疫治疗。研究结果表明，该贴片显著抑制了原发性肝肿瘤进展和腹水形成，并在恶性肝肿瘤模型中防止了80%治疗小鼠的局部复发。机制上，其疗效依赖于NK细胞的活化和cGAS-STING通路的激活。临床分析显示，较高的NK细胞浸润与患者良好预后相关。此多功能贴片为晚期HCC患者提供了一种有前景的治疗策略。

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球范围内一个严峻的健康挑战，其发病率和死亡率逐年上升。复发和转移是导致HCC患者死亡的主要原因，而这背后，一个免疫抑制的肿瘤微环境扮演了关键角色。传统的治疗方法往往难以根除肿瘤，且容易复发。近年来， immunotherapy（免疫治疗）展现出巨大潜力，但如何有效激活患者自身的免疫系统，特别是肝脏中本应发挥重要作用的自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK cells），并克服肿瘤局部的缺氧和免疫抑制环境，成为了研究人员亟待解决的难题。与此同时，传统中药茯苓中提取的活性成分茯苓多糖（Pachymaran, P）被证明具有调节免疫的潜力，但其在体内的递送和靶向性是一个瓶颈。将先进的纳米材料、光动力治疗（Photodynamic Therapy, PDT）与免疫调节相结合，或许能开辟一条新的治疗途径。基于此，研究人员在《Advanced Science》上发表了一项创新研究，他们设计了一种可通过腹腔镜递送的多功能柔性贴片，旨在对HCC进行局部精准打击，并调动全身免疫应答。

为开展此项研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，他们通过溶胶-凝胶法和静电纺丝技术合成了二氧化硅（SiO₂）凝胶纤维，并经过氮气烧结和高锰酸钾碳还原，制备了中空的二氧化锰（MnO₂）纳米纤维（nanofibers, NFs）作为药物载体。其次，通过静电吸附法将茯苓多糖（P）和光敏剂吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）共同负载到MnO₂NFs上，构建了复合药物递送系统MnO₂-P-ICG NFs。在体内外模型中，研究采用了CCK-8法、流式细胞术、Transwell实验、活死细胞染色、蛋白质印迹（Western Blot）、免疫组织化学/免疫荧光等技术评估了材料的生物相容性、抗肿瘤效果及免疫调节机制。此外，研究建立了小鼠皮下、原位肝癌、肿瘤复发及双侧肿瘤模型，并利用小动物活体成像系统进行疗效监测。临床样本分析则来源于福建医科大学孟超肝胆医院经伦理批准的24例HCC患者手术标本。

研究结果

2.1 茯苓多糖调节免疫微环境并调控肿瘤细胞迁移

研究人员首先探究了茯苓多糖的免疫调节作用。通过腹腔注射茯苓多糖治疗荷瘤小鼠，发现其能显著抑制H22肿瘤细胞的腹水转移。对肿瘤组织进行RNA测序分析显示，茯苓多糖处理引起了大量差异表达基因，并利用CIBERSORT工具分析发现，肿瘤组织中先天免疫细胞（如活化的NK细胞、M1型巨噬细胞和单核细胞）的比例和浸润评分增加。流式细胞术进一步证实，茯苓多糖增加了小鼠腹腔淋巴结中树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）、NK细胞和巨噬细胞的比例，并显著提升了NK细胞表面激活受体NKG2D的表达。体外实验表明，适当浓度的茯苓多糖能直接增强原代NK细胞的活化。然而，茯苓多糖本身并不显著影响肿瘤细胞的增殖，但能有效抑制其迁移能力。这些结果说明，茯苓多糖主要通过调节先天免疫细胞（尤其是NK细胞）的分布和活化，并抑制肿瘤细胞迁移来发挥抗肿瘤作用。

2.2 MnO₂-P-ICG NFs的构建与表征

研究团队成功构建了复合药物递送系统。他们以SiO₂/C复合纤维为模板，通过水热还原法制备了直径约200纳米、具有均匀中空结构的MnO₂纳米纤维，其高比表面积有利于药物负载。随后，通过静电吸附将带负电的茯苓多糖和ICG负载到经聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）修饰后带正电的MnO₂NFs上，形成了MnO₂-P-ICG NFs。表征结果显示，该复合材料在酸性条件下能响应性释放茯苓多糖，并且MnO₂能与肿瘤微环境中高浓度的过氧化氢（H₂O₂）反应生成氧气，缓解肿瘤缺氧。在近红外光照射下，该系统能有效产生活性氧，显示出良好的PDT潜力。

2.3 MnO₂-P-ICG NFs的体外抗肿瘤治疗

生物安全性评估显示，各组分在适当浓度下对正常小鼠肝细胞毒性较小。在NK细胞与肝癌细胞的共培养体系中，评估了该复合系统的疗效。研究发现，单独的茯苓多糖处理能通过激活NK细胞显著降低肿瘤细胞活力；而MnO₂-P-ICG NFs在近红外光照射下，能更显著地抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡并抑制其迁移，表现出PDT与免疫调节的协同效应。

2.4 MnO₂-P-ICG NF在体外激活NK细胞

流式细胞术和荧光染色实验证实，即使在没有PDT的情况下，MnO₂-P-ICG NFs也能显著提高NK细胞的活化比例。在近红外光诱导的PDT作用下，该贴片能进一步增强NK细胞的活化及其对靶肿瘤细胞的杀伤毒性。这表明茯苓多糖和ICG诱导的PDT在激活NK细胞方面存在协同作用。

2.5 MnO₂-P-ICG NFs的延展性、分布、生物相容性与摄取

模拟腹腔镜操作显示，载药贴片具有良好的柔韧性和延展性，可通过套管并恢复原状。体内分布实验表明，局部应用的贴片能长时间富集在肿瘤部位，增加瘤内药物浓度，同时维持较低的血浆药物水平。组织病理学分析和体重监测证实MnO₂NFs具有良好的生物相容性，可在体内逐渐代谢。荧光成像和透射电镜观察发现，纳米纤维不易被细胞大量内吞，其主要通过将药物释放到肿瘤微环境中发挥作用。

2.6 MnO₂-P-ICG NFs的体内抗肿瘤效应

在小鼠原位肝癌模型中，局部应用MnO₂-P-ICG NFs并进行近红外光照射，能最有效地抑制原发性肿瘤的生长。在具有高侵袭性的H22细胞原位模型中，该复合系统不仅能抑制原发性肿瘤生长，还能显著抑制肿瘤的远处转移和腹水形成，并延长小鼠生存期。在肿瘤复发模型中，贴片治疗也能显著抑制术后肿瘤复发。此外，在双侧肿瘤模型中，仅对原发瘤进行治疗即可抑制远处未处理肿瘤的生长，表明该局部治疗能引发全身性的抗肿瘤免疫效应。

2.7 MnO₂-P-ICG NFs促进肿瘤微环境中免疫细胞浸润与活化

免疫组织化学和流式细胞术分析显示，MnO₂-P-ICG NFs治疗能显著增加NK细胞在肿瘤、脾脏和腹腔淋巴结中的浸润。更重要的是，它提高了肿瘤微环境中NK细胞的活化比例（NKG2D⁺）。免疫荧光分析也证实了治疗后肿瘤内NK细胞浸润、NKG2D和干扰素-γ表达的上调。同时，PDT诱导了肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡，伴随着钙网蛋白暴露和高迁移率族蛋白B1释放等损伤相关分子模式的产生。

2.8 MnO₂-P-ICG NFs激活cGAS-STING通路以增强先天免疫应答

机制探究发现，MnO₂-P-ICG NFs能上调肿瘤细胞中cGAS-STING通路下游信号蛋白TBK1和磷酸化NF-κB的表达。在体内，该治疗也显著增加了肿瘤组织中cGAS、磷酸化STING以及下游磷酸化TBK1、NF-κB和IRF3的表达。这表明该系统通过激活cGAS-STING通路来增强免疫细胞活化和先天免疫反应。

2.9 抑制cGAS-STING通路削弱MnO₂-P-ICG NFs的治疗效果

为了验证cGAS-STING通路的关键作用，研究人员使用了STING抑制剂。结果表明，药理学抑制cGAS-STING通路会显著减弱MnO₂-P-ICG NFs的治疗效果，特别是其抑制肿瘤腹水转移的能力，并缩短小鼠生存期。通路抑制还降低了肿瘤微环境中活化NK细胞的比例。这些发现证实，cGAS-STING通路的激活对于该贴片介导的NK细胞活化和抗肿瘤疗效至关重要。

2.10 NK细胞和活化NK细胞的高浸润与HCC患者预后改善相关

对24例HCC患者手术标本的分析显示，肿瘤组织中NK细胞（CD56⁺）和活化NK细胞（CD56⁺CD107a⁺）的高浸润与更长的无进展生存期和总生存期显著相关。这从临床角度支持了激活NK细胞作为治疗策略的潜在价值。

研究结论与讨论

该研究成功地构建了一种基于中空MnO₂纳米纤维的多功能复合贴片MnO₂-P-ICG NFs，用于HCC的局部联合治疗。该系统创新性地整合了材料科学、传统中药和现代免疫治疗理念。其重要意义体现在多个层面：首先，在功能上，它同时解决了肿瘤缺氧和免疫抑制两大难题。MnO₂不仅能缓解缺氧、增强PDT效果，其反应产生的Mn²⁺还能作为免疫佐剂；茯苓多糖则专一性地激活和招募NK细胞；ICG介导的PDT直接杀伤肿瘤并诱导免疫原性细胞死亡。三者协同，实现了 PDT 与免疫治疗的强力联合。其次，在递送方式上，该贴片设计柔韧，可通过腹腔镜微创手术精准植入，实现了药物的局部持续释放，提高了靶向性并减少了全身副作用，具有良好的临床转化前景。再者，在机制上，研究不仅证实了NK细胞在该疗法中的核心地位，还深入阐明了其通过诱导免疫原性细胞死亡、激活cGAS-STING先天免疫通路来活化NK细胞的分子机制，为类似联合疗法提供了理论依据。最后，临床相关性分析表明，肿瘤内NK细胞活性与患者预后正相关，进一步佐证了该治疗策略的临床意义。

尽管该研究取得了令人瞩目的成果，作者也指出了其局限性，例如茯苓多糖激活先天免疫细胞的具体机制有待进一步阐明，并且除了NK细胞外，其他免疫细胞亚群在该疗法中的参与和相互作用尚未系统研究。然而，这项工作无疑为晚期HCC的治疗提供了一种具有巨大潜力的新策略。它展示了一种将纳米技术、局部治疗和免疫调节相结合，以对抗肝脏这一免疫特殊器官中恶性肿瘤的创新范式，并为其他腹腔实体瘤的治疗提供了可借鉴的平台。