利用X射线吸收光谱技术研究类胆色素化合物中轴向键合的弱化现象：对类胆色素铁硫蛋白的启示

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Investigating weak axial ligation in corrinoids by X-ray absorption spectroscopy: Implications for corrinoid iron-sulfur protein

甲基钴胺蛋白（CFeSP）的甲基转移活性源于trans-轴向弱水配体与Co-CH3键的协同作用，XAS和DFT分析表明其配位数为6而非5。

　　

Kewei Zhao | Macon J. Abernathy | Claire Griffith | Duncan J. Kountz | Daniel Esckilsen | Stephen W. Ragsdale | Ritimukta Sarangi

斯坦福同步辐射光源（Stanford Synchrotron Radiation Lightsource），SLAC国家加速器实验室（SLAC National Accelerator Laboratory），加利福尼亚州门洛帕克（Menlo Park, CA 94025），美国

摘要

Corrinoid铁硫蛋白（CFeSP）是Wood-Ljungdahl途径中的甲基转移酶，但其相对于小分子类似物的更高催化效率所依赖的几何和电子结构仍存在争议。虽然已知轴向配位可以调节B₁₂依赖性酶的活性，但在“未结合基团”状态（如甲基化的CFeSP（Me-CFeSP）中，由于标准结构探针难以检测到弱相互作用，尽管溶液相光谱学已经暗示了这些相互作用的存在。本文利用钴K边X射线吸收光谱（XAS）和理论分析（DFT、TD-DFT和QM/MM）研究了多种甲基化的corrinoids：甲基钴胺素（methylcobalamin）、甲基钴胺（methylcobinamide）和Me-CFeSP。我们的结果表明，尽管这些化合物中的钴-CH₃键长相似，但钴K前缘特征的光谱强度有所增加，并且能量向低处移动。分析显示，这些光谱特征是由钴配体与trans-轴方向的距离变化引起的；由于corrin环的对称性较低，trans-轴配体的光谱特征与甲基基团分离。这些结果提供了额外的定量证据，表明溶液中的Me-CFeSP含有一个结合较弱的trans-轴水配体，而不是最近的结构和XAS研究估计的5配位结构。这种微弱的配位作用调节了前沿轨道能量，降低了钴-C键的解离能，从而部分解释了CFeSP较高的甲基转移速率。总体而言，这项工作为诊断corrinoids中的未解决轴向配位问题建立了光谱和计算基础，表明这种相互作用可能是“未结合基团”B₁₂酶学中的一个普遍存在但未被充分认识的特征。

引言

Corrinoids是少数能够在三维过渡金属中心支持有机金属化学反应的生物辅因子之一[1]。在B₁₂依赖性酶中，轴向配位通常控制着反应机制：它调节钴-C键的强度和稳定性[2]，改变钴的还原电位[3]，并重塑介导甲基转移和自由基反应的价轨道[4]。在“未结合基团”的corrinoids中，当较低轴位置的二甲基苯并咪唑（DMB）被取代时，任何剩余的较低轴相互作用（溶剂、蛋白质侧链或无配体）对反应性的影响变得重要，但从晶体学或冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据中难以明确确定。当这种相互作用较弱时，这种不确定性尤为明显，因为钴配体距离的微小变化会对电子结构产生显著影响，而这些变化又接近许多结构探针的分辨率极限。

Corrinoid铁硫蛋白（CFeSP）是Wood-Ljungdahl途径中的甲基转移酶[5]，这一例子体现了这一挑战，因为文献中对其甲基化形式Me-CFeSP中的trans-轴配体身份存在广泛讨论。早期的溶液相光学吸收（Abs）和磁圆二色性（MCD）测量结果被解释为存在一个结合较弱的水配体，表明钴中心为6配位[6]。相比之下，Me-CFeSP的晶体结构显示为“未结合基团”构象，未检测到结合的水分子或配位的蛋白质侧链[7]。最近，通过钴K边X射线吸收光谱（XAS）结合理论分析，有人提出钴中心为5配位[8]。这些不同的解释反映了现有探针的互补优势和局限性：Abs/MCD对电子结构非常敏感，但对于抗磁性的钴(III) corrinoids来说难以定量解释；溶液相中的轴向配位可能在晶体状态下无法保留；XAS的解释可能受到样品异质性和光谱分辨率的影响。由于结构和光谱数据常用于构建和验证理论模型，配位数或轴向键长的不确定性可能会传递到理论描述中。在corrinoids中，轴向配位的微小变化会显著扰动钴的电子结构[9]，因此无法检测到弱轴向配体或准确定义钴-O键的距离可能导致理论描述出现偏差。

为了解决这一结构上的不确定性，我们仔细测量并分析了溶液中的Me-CFeSP以及甲基钴胺素（MeCbl，结合基团状态）和甲基钴胺（MeCbi，未结合基团状态）的钴K前缘光谱。钴K前缘特征可以反映配位对价轨道对称性和共价性的影响[10]。尽管1s→3d跃迁是四极允许的且强度较弱，但当3d受体通过几何畸变和金属-配体共价性与4p轨道混合时，其强度会增加[11]、[12]。先前的钴钴胺素XAS研究表明，随着轴向配体和corrin环畸变的变化，corrinoid前缘特征具有丰富的变异性[8]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。在甲基化物种中，弱trans-轴配体对钴K前缘的影响被认为与钴-C_z²轨道相互作用有关，这一点之前通过Abs/MCD数据得到了证实[6]、[9]。本文提供了Me-CFeSP与MeCbl和MeCbi的钴K边XAS数据对比，并系统评估了这一系列化合物前缘强度和能量的差异。我们还结合了扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）和密度泛函理论（DFT）计算。结果表明，前缘强度和能量不仅受钴-C键长度的影响，还受到trans-轴相互作用的影响更大。这使我们能够开发出一种定量方法，并揭示Me-CFeSP的光谱特征与5配位几何结构不符，更符合存在一个较弱的trans-轴水配体的情况。XAS、理论分析和支持性的EXAFS数据的结合使我们能够将Me-CFeSP中的钴-O键距离确定在2.35至2.45 ?之间。这些发现与早期的Abs/MCD研究结果一致，并暗示了溶液相和晶体相中钴配位环境的潜在差异。Me-CFeSP中存在的弱trans-轴配位也有助于解释其相对于小分子类似物更高的甲基转移效率。更广泛地说，我们的分析为使用前缘特征诊断其他B₁₂依赖性酶中的微弱轴向相互作用提供了一种方法。

甲基化corrinoids的光谱表征

从Moorella thermoacetica中纯化的甲基化钴(III) CFeSP（Me-CFeSP）显示出预期的UV–Vis吸收带，中心波长为450 nm（图S1）[23]。甲基钴胺素（MeCbl）、甲基钴胺（MeCbi）和Me-CFeSP的标准化钴K边XAS光谱如图1A所示。插图显示了扩展的前缘区域。在一系列甲基化corrin复合物中观察到明显的强度和能量趋势。

文献中对MeCb复合物轴向配位的描述

文献中对Me-CFeSP的轴向配位描述存在不一致，既有报道为5配位也有6配位的结论[6]、[7]、[8]。早期的溶液相光学光谱（Abs/MCD）研究表明，Me-CFeSP的光谱与腺苷钴胺（adenosyl cobinamide）相似[6]，后者是一种已知能结合水的结构相关的烷基-B₁₂衍生物[4]，这表明Me-CFeSP中可能存在氧配体。我们的溶液相XAS结果与这一解释一致。

结论

在这项工作中，我们利用钴K前缘分析以及钴K边EXAFS和DFT/TD-DFT计算来评估corrinoids中的弱轴向配位。我们证明了在这些系统中，轴向甲基基团的前缘贡献与trans-轴配体的贡献是分离的，从而可以直接评估弱trans-轴相互作用。将这种方法应用于Me-CFeSP，提供了溶液中存在弱结合trans-轴水配体的定量证据，这有助于解释相关现象。

CRediT作者贡献声明

Kewei Zhao：撰写——审稿与编辑、原始稿撰写、实验研究、形式分析。Macon J. Abernathy：撰写——审稿与编辑、实验研究。Claire Griffith：撰写——审稿与编辑、实验研究。Duncan J. Kountz：撰写——审稿与编辑、实验研究。Daniel Esckilsen：撰写——审稿与编辑、实验研究。Stephen W. Ragsdale：撰写——审稿与编辑、资源获取、概念构思。Ritimukta Sarangi：撰写——审稿与编辑、

资助

能源部基础能源科学领域工作提案100,593（R.S）。美国国立卫生研究院（NIH）资助R35-GM141758（S.W.R）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

SSRL结构分子生物学项目得到了DOE生物与环境研究办公室以及NIH国家普通医学科学研究所（包括P41GM103393）的支持。我们感谢Alison Biester博士在RCSB蛋白质数据库调查方面提供的帮助。

S.W.R.个人致谢：我第一次遇到Harry Gray是在加利福尼亚州圣巴巴拉附近的Miramar酒店举行的首届“生物中的金属”戈登研究会议上。那次会议改变了我的人生，让我