《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Virulence-gene anchored multiplex PCR assay for detection and spatial mapping of cotton root rot disease complex in field soils
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本研究开发了一种多重PCR（mPCR）方法，用于同时检测棉花根腐病复合体中的三种病原体：Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani和Meloidogyne incognita。该方法通过靶向病原体的特异性基因（如nitrilase基因、蛋白酶R基因和食管腺细胞分泌蛋白基因），实现了高灵敏度和特异性，检测限分别为100 pg DNA、315 bp和920 bp。验证显示该方法适用于土壤样本检测，并整合空间映射技术，揭示了哈里亚纳邦棉花种植区病原体的分布和共感染模式，为精准防治提供依据。
舒巴姆·萨伊尼（Shubham Saini）、阿尼尔·库马尔·萨伊尼（Anil Kumar Saini）、拉凯什·库马尔（Rakesh Kumar）、卡马尔·马利克（Karmal Malik）、阿德什·库马尔（Adesh Kumar）、阿尼尔·库马尔（Anil Kumar）、普里扬卡·杜加尔（Priyanka Duggal）、穆克什·库马尔（Mukesh Kumar）、基肖尔·库马尔（Kishor Kumar）、舒巴姆·兰巴（Shubham Lamba）、潘库里·辛格哈尔（Pankhuri Singhal）、希玛尼·萨伊尼（Himani Saini）、穆库尔·库马尔·班布（Mukul Kumar Bhambhu）
印度哈里亚纳邦希萨尔（Hisar）的CCS哈里亚纳农业大学（CCS Haryana Agricultural University）植物病理学系
摘要
由Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani和Meloidogyne incognita引起的棉花根腐病复合体对棉花生产构成了严重威胁。这些病原体在根际环境中频繁共存并产生协同作用，导致根部严重受损、植物生长受阻以及产量大幅下降。传统的诊断方法耗时且劳动强度高，通常无法区分共感染的病原体，从而限制了疾病的及时监测和管理。为了解决这一问题，本研究尝试开发了一种多重PCR（mPCR）检测方法，可以直接从土壤样本中同时检测M. phaseolina、R. solani和M. incognita。该检测方法使用了针对关键致病性的特异性引物：M. phaseolina的硝化酶基因（552 bp）、R. solani的蛋白酶R基因（315 bp）以及M. incognitaMacrophomina phaseolina和R. solani的检测限为100 pg DNA，而M. incognita的检测限可低至10 ng。通过对土壤样本的验证，证明了该方法在早期检测中的可靠性。此外，mPCR检测结果还与空间映射结合使用，以绘制哈里亚纳邦主要棉花种植区的病原体分布和共存模式。这些地图揭示了单一感染和混合感染的热点区域，为了解疾病流行病学和风险区提供了重要信息。本研究表明，基于致病基因的mPCR是一种快速、经济高效且可靠的诊断工具，有助于制定棉花根腐病复合体的综合管理策略。
引言
棉花（Gossypium属）是全球最重要的纤维作物之一，对全球纺织业和农村生计贡献巨大。然而，其生产力受到多种土传病原体和线虫的严重制约，这些病原体和线虫共同导致了严重的根腐病问题。其中，Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum和根结线虫Meloidogyne incognita尤其令人担忧，因为它们分布广泛、寄主范围广，并在根际环境中具有协同作用[[1], [2], [3], [4]]。M. phaseolina在高温干燥条件下会引起广泛的根部和茎部损伤，导致植株早死和产量损失；R. solani这种坏死性真菌会导致棉花根腐病、猝倒病和茎溃疡，进一步损害根部功能和幼苗生长。而M. incognita会在棉花根部形成瘤状物，干扰养分和水分吸收，使植株容易受到二次感染。当这些病原体和线虫共存时，会引发“根腐病复合体”，线虫造成的伤口和生理胁迫为真菌侵入提供了条件，而真菌的定殖又促进了线虫的繁殖，从而对植物生长、纤维质量和产量产生多重负面影响。在印度及全球许多棉花种植区，根腐病复合体是一个严峻的挑战，尤其是在单一作物种植、沙质土壤和非生物胁迫（如干旱）条件下。依赖杀菌剂和杀线虫剂的传统管理方法效果有限，且存在环境安全和可持续性的问题。缺乏快速准确的诊断工具进一步阻碍了及时干预，常常在问题被发现之前就导致严重减产。此外，病原体和线虫之间的协同作用加剧了根部损伤，使得单独管理这些病原体变得困难。因此，迫切需要结合精确诊断、疾病监测和可持续管理策略的综合方法。
准确快速地识别致病因子是制定及时有效管理措施的前提[5]。然而，由于M. phaseolina、R. solani和M. incognita引起的症状重叠，早期准确检测棉花根腐病复合体颇具挑战性。地上症状如萎蔫、黄化、生长受阻和早衰是非特异性的，容易与营养缺乏或其他生物和非生物胁迫混淆。传统的诊断方法（包括形态学和培养特征分析、显微镜观察及致病性测定）劳动强度高、耗时长，且往往无法区分密切相关的物种或共感染的病原体和线虫[[6], [7], [8], [9], [11]]。同样，基于肛门图案或形态测量特征的线虫鉴定需要专业知识，在田间条件下并不总是可靠的。这些限制阻碍了疾病的及时监测、地图绘制和有效管理策略的实施。
分子诊断技术的进步为克服这些挑战提供了机会，可以通过针对病原体和线虫特异性基因标记来进行检测。基于聚合酶链反应（PCR）的检测方法能够直接从受感染植物组织或土壤中高灵敏度地检测病原体。多重PCR（mPCR）通过一次反应同时检测多种病原体，进一步提高了诊断效率，减少了时间和成本。这类工具在解析由真菌和线虫相互作用引起的复杂疾病方面尤其有价值。多重PCR（mPCR）的概念最初由Chamberlain等人提出[12]，此后被广泛应用于多种作物的病原体检测。由于其高效性、操作简便性、经济性和系统性，mPCR已成为传统诊断方法的强大替代方案，并迅速发展用于植物病原体检测。例如，Sun等人[13]设计了针对小麦中五种常见土传真菌的多重PCR检测方法，检测限低至0.39 ng的菌丝DNA；Wallon等人[14]建立了基于ITS序列的Rhizoctonia solani及其AG1-IB融合群的双重PCR系统，检测限达到每克干土1 μg的菌丝生物量；Villarino等人[15]开发了同时检测Fusarium solani和Fusarium oxysporum的双重PCR平台；Thapa等人[16]使用Clavibacter michiganensis的染色体基因rhuM和tomA以及植物16S rRNA基因作为内控，检测限为0.01 ng DNA。Xue等人[17]基于外壳蛋白基因构建了检测Soybean mosaic virus、Bean common mosaic virus和Cucumber mosaic virus的三重PCR系统，证明了多重PCR在病毒诊断中的广泛应用。然而，尽管多重PCR技术在检测多种作物的真菌、细菌和病毒病原体方面应用广泛，但目前尚未针对M. phaseolina、R. solani和M. incognita引起的棉花根腐病复合体开发出标准化诊断方法。这一空白尤为重要，因为这些病原体和线虫在根际环境中经常共存并产生协同作用，导致疾病严重性和产量损失加剧。因此，缺乏快速、灵敏且经济高效的分子检测方法阻碍了棉花种植区的精准疾病监测和早期诊断。因此，本研究旨在开发一种多重PCR检测方法，同时检测与棉花根腐病复合体相关的M. phaseolina、R. solani和M. incognita》。通过针对功能相关基因，该检测方法克服了传统诊断标记的局限性，确保了病原体鉴定的高特异性。此外，该方法还用于绘制印度哈里亚纳邦棉花种植区的病原体分布图，揭示了它们的分布、共存情况及其对可持续管理的潜在影响。将分子诊断与空间流行病学相结合，为追踪M. phaseolina、R. solani和M. incognita的分布、评估病原体-线虫关联及识别风险区域提供了有力框架。
病原体分离株
本研究使用了印度哈里亚纳邦希萨尔（Hisar）Chaudhary Charan Singh哈里亚纳农业大学（Chaudhary Charan Singh Haryana Agricultural University）植物病理学系保存的18株真菌分离株。根据形态-培养特征和rRNA ITS或β-微管蛋白/翻译延伸因子部分基因测序等分子鉴定技术，这些分离株被鉴定为：5株M. phaseolina（来自棉花和鹰嘴豆）[4]，3株R. solani
引物设计及计算机模拟验证
针对M. phaseolina、R. solani和M. incognita设计了特异性引物，这些引物基于高度保守且与物种相关的基因。引物设计使用Primer Quest工具，并通过Oligo Analyzer和NCBI Primer-BLAST进行了计算机模拟验证，确认了它们的特异性且无交叉反应。
讨论
基于PCR的检测方法已被开发用于识别多种植物病原体，如病毒、细菌和真菌[5],[22],[23],[24],[25],[26]]。在此基础上，本研究首次在国家和全球范围内提出了一种基于mPCR的诊断方法，用于同时检测M. phaseolina、R. solani和M. incognita>，标志着棉花根腐病准确诊断和空间绘图的重大进展。
CRediT作者贡献声明
舒巴姆·萨伊尼（Shubham Saini）：撰写原始稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
阿尼尔·库马尔·萨伊尼（Anil Kumar Saini）：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、概念构思。
拉凯什·库马尔（Rakesh Kumar）：监督。
卡马尔·马利克（Karmal Malik）：资源获取、资金筹集。
阿德什·库马尔（Adesh Kumar）：撰写、审稿与编辑、验证、实验研究。
普里扬卡·杜加尔（Priyanka Duggal）：方法学设计、数据分析。
穆克什·库马尔（Mukesh Kumar）：资源支持、方法学设计。
基肖尔（Kishor）：参与同意
不适用。
出版同意
所有作者同意发表提交的手稿版本。
大型语言模型的使用
大型语言模型（LLMs）被用于辅助文本编辑，以提高清晰度和风格。最终内容和工作责任仍完全由手稿作者承担。
伦理批准
不适用。
资金情况
作者声明在准备本手稿过程中未收到任何资金、资助或其他支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
