通过配体工程改造的空心Fe-NC纳米酶具有增强的过氧化物酶活性，可用于基于智能手机的现场检测方法，以检测异烟肼（isoniazid）

《Analytica Chimica Acta》：Ligand-engineered hollow Fe-NC nanozymes with enhanced peroxidase activity for smartphone-based point-of-care testing of isoniazid

治疗药物监测对异烟肼（INH）至关重要，因其窄治疗窗易导致毒性或耐药。本研究开发了一种基于空心Fe-NC纳米酶的纸基颜色反应平台，结合智能手机读取实现快速、灵敏（检测限0.24 μM）的INH检测，适用于资源有限地区。

　　

Xinyue Zhou|Yu Zhang|Tongxin Sun|Xu Xu|Lei Zhang

辽宁大学化学学院，中国沈阳110036

摘要

异烟肼（INH）是一线抗结核药物，由于其治疗窗口狭窄，在非最佳浓度下存在毒性和耐药性的风险，因此对其进行治疗药物监测至关重要。目前的方法缺乏适用于即时检测（POCT）的简便性和易用性，尤其是在资源有限的环境中。本文报道了一种基于纸片的比色生物传感平台，该平台将中空结构的Fe-NC（铁-氮-碳）纳米酶与智能手机辅助读数技术相结合，用于快速、灵敏且选择性地检测人体生物流体中的INH。这种纳米酶是通过控制热解双连接剂沸石咪唑/四唑框架（ZTF）合成的，其中2-甲基咪唑（2-MIM）和热不稳定的5-氨基四唑（5-AT）引导形成中空结构，从而最大化可访问的Fe-N₄活性位点并增强质量传输。这种设计赋予了类似过氧化物酶的活性，能够在H₂O₂存在下高特异性地催化显色底物的氧化。所开发的传感器检测限达到0.24 μM，并在人血清和尿液中保持高准确性，且基质干扰最小。整个检测过程使用便携式低成本设备和智能手机应用程序进行比色分析。该平台在人尿液和血清上进行了验证，表现出优异的重现性、稳定性和现场适应性。这项工作通过配体介导的结构控制提出了一种合理的纳米酶设计策略，并建立了一个可扩展的、无需设备的传感框架，用于POCT中的实时治疗药物监测。

引言

异烟肼（INH）是治疗结核病（TB）的一线抗生素，结核病是全球传染病死亡的主要原因之一[1]、[2]。其临床疗效、低成本和良好的安全性使其在全球结核病控制计划中占据重要地位。然而，由于遗传多态性（例如NAT2乙酰化酶状态）、肝功能以及药物相互作用，患者之间的药代动力学存在差异，即使是在标准化剂量下，体内INH浓度也会出现显著波动。INH的治疗窗口较窄，最佳血清浓度范围为3至6 μg/mL^-1。低于治疗水平的浓度会增加治疗失败和耐药性的风险，而高于治疗水平的浓度则与肝毒性和神经毒性相关[3]、[4]、[5]。鉴于血浆峰值浓度在给药后1-2小时内出现，精确和及时的INH水平监测对于剂量个体化和改善治疗效果至关重要。目前用于INH定量的金标准方法（如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和质谱法（MS）具有高灵敏度和特异性，但受到高昂仪器成本、分析时间长以及需要集中实验室和受过培训人员的限制。虽然已经探索了荧光、化学发光和电化学检测等替代技术，但这些技术往往稳定性有限、易受基质干扰或操作要求复杂[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。这些限制阻碍了它们在即时检测（POCT）中的应用，尤其是在结核病负担最重的资源有限地区[11]。

比色传感作为一种有前景的POCT替代方法，因其简单性、可视读数能力和与低成本便携式平台的兼容性而受到关注[12]。在比色策略中，基于纳米酶的系统（模仿天然酶活性的纳米材料）因其高稳定性、易于储存和催化信号放大而受到广泛关注[13]。特别是类似过氧化物酶的纳米酶，能够在H₂O₂存在下催化显色底物（如TMB）的氧化，产生与分析物浓度成比例的可见颜色变化。尽管具有这些优势，但由于与天然酶相比催化效率相对较低，纳米酶在POCT中的实际应用仍受到限制，尤其是在复杂的生物基质中[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。

为了克服这一限制，人们通过合理设计纳米酶的尺寸、组成、形态和表面化学性质来优化其性能[19]、[20]、[21]、[22]。值得注意的是，中空结构的纳米材料作为高效的催化纳米反应器出现，提供了增强的质量传输和最大化的活性位点暴露[23]、[24]。过渡金属掺杂的碳（M-NC）纳米结构是最有前景的候选材料之一，它们结合了高催化活性、优异的化学稳定性和原子级分散的金属中心（如Fe-N_x）。这些材料通常来源于金属有机框架（MOFs），由于其明确的孔隙率、可调组成和三维结构，成为理想的牺牲模板[25]、[26]、[27]。沸石咪唑框架（ZIFs），特别是ZIF-8，由于其高碳和氮含量、热稳定性和均匀的形态，被广泛用作N掺杂多孔碳的前体。将Fe引入ZIF-8后，可以通过热解形成Fe-NC纳米酶，其中Fe-N_x位点分布均匀[28]、[29]。然而，传统的热解方法通常会产生致密的碳框架，限制了底物的扩散并掩埋了大量催化活性位点，从而限制了整体性能[30]、[31]。

为了解决这一挑战，我们提出了一种通过配体工程策略制备中空结构Fe-NC纳米酶的方法，以最大化活性位点的可访问性。设计了一种使用2-甲基咪唑（2-MIM）和热不稳定的5-氨基四唑（5-AT）作为共配体的双连接剂沸石四唑框架（ZTF）。在热解过程中，5-AT原位分解，生成气态副产物，作为动态模板形成中空多孔结构。这种3D开放结构增强了质量传输，显著增加了活性Fe位点的暴露，从而表现出卓越的类似过氧化物酶的活性，超过了许多传统纳米酶。利用这种催化放大效应，我们开发了一种基于INH抑制纳米酶催化的TMB-H₂O₂反应的选择性比色检测方法。该方法被集成到基于纸片的微流控设备中，并与智能手机颜色计结合进行定量读数，实现了对人血清和尿液中INH的快速、无需设备的分析（方案1）。该平台的检测限达到0.24 μM，远低于治疗窗口的下限，并表现出优异的重现性、选择性和抗基质干扰能力。这项工作通过配体介导的结构工程提出了一种合理的纳米酶设计方法，并建立了一个可扩展的、可在现场部署的传感系统，用于POCT中的实时治疗药物监测。

材料

2-甲基咪唑（2-MIM）、乙酸（HAc）、乙酸钠（NaOAc）、过氧化氢（H₂O₂）、5-氨基四唑一水合物（5-AT）、甲醇、盐酸、氯化铵（NH₄Cl）、醋酸锌（Zn(CH₃COO)₂·2H₂O）和氯化铁（FeCl₃从Sinopharm化学试剂公司购买。3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、2,2′-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、邻苯二胺（OPD）和异烟肼（INH）从上海Aladdin公司获得

Fe-NC的表征

使用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）系统地表征了NC和Fe-NC的形态和结构特性。如图1a和b所示，NC显示出由紧密堆叠的纳米片组成的明确微球形超结构，直径约为1 μm，具有均匀的分布和光滑的表面。

结论

总之，本研究开发了一种基于双连接剂ZTF的Fe-NC纳米酶，由于其中空介孔结构，最大化了催化活性Fe-N₄位点的暴露并促进了高效的质量传输，因此表现出卓越的类似过氧化物酶的活性。利用这种高催化性能，我们开发了一个集成的POCT平台，该平台结合了基于纸片的传感器和智能手机辅助的比色技术，实现了快速、灵敏且选择性的检测

CRediT作者贡献声明

Lei Zhang：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取。Yu Zhang：验证、方法学、研究。Xinyue Zhou：撰写 – 原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。Xu Xu：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取。Tongxin Sun：可视化、方法学、研究

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32102086）的财政支持。作者还感谢Scientific Compass（www.shiyanjia.com）在XPS实验中的技术协助。