新型双齿季铵型固定相的简易制备方法，用于亲水相互作用液相色谱中多种分析物的分离

《Analytica Chimica Acta》：Facile preparation of new bidentate quaternary ammonium-type stationary phase for the separation of versatile analytes in hydrophilic interaction liquid chromatography

双齿季铵盐固定相QAS通过双齿结构提升水合稳定性与分离效率，适用于极性化合物分析。

　　

程晓东|谭凯峰|林彩勇|李云萍|戴学新

黔南民族师范学院化学与化学工程学院，中国都匀市，558000

摘要:

背景

亲水相互作用液相色谱（HILIC）是一种广泛用于极性化合物在极性固定相上分离的方法。传统的HILIC固定相，如二醇、两性离子、氨基、酰胺等极性配体，已经为基于亲水相互作用的分离建立了良好的基础。然而，通过创新的结构设计开发具有增强亲水性、选择性和稳定性的新型材料已成为关键的研究焦点。

结果

在这项研究中，制备了一种名为QAS的新固定相，它源自一种含有两个三乙氧基硅烷功能团的双齿季铵配体。合成过程包括（3-缩水甘油氧基丙基）三乙氧基硅烷与（N,N-二乙基-3-氨基丙基）三甲氧基硅烷的反应，形成中间体，然后将其固定在硅胶上。成功表征QAS后，我们在不同的洗脱条件下对其色谱行为进行了研究，包括改变乙腈含量、盐浓度和pH值。制备了三种固定相：QAS、二乙氨基型固定相（DAS）和环氧丙氧基型固定相（EPS）。使用核苷、核碱基衍生物、有机芳香酸和生物碱比较了这三种固定相和商业Luna NH₂柱的分离性能。其中，QAS表现出更优异的分离效率。

意义

QAS固定相具有通过简单合成路线制备的双齿三乙氧基硅烷结构，显示出较低的残余硅醇活性、增强的水解稳定性以及显著提高的极性化合物在HILIC模式下的分离效率和选择性。它为亲水和复杂样品的分析提供了一种有前景的解决方案。

引言

在过去的几十年中，分析科学领域的高性能液相色谱（HPLC）取得了显著进展[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。作为这一学科的关键分支，反相液相色谱（RPLC）主导了大多数色谱分离任务[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。C18固定相与水的极性对比明显，提供了在流动相选择方面的极大灵活性，并能够有效分离各种化合物[17]、[18]。这导致了C18柱在色谱领域的主导地位。然而，传统的C18柱在分离强极性化合物时仍面临挑战，表现为保留能力差和分离效率低[19]、[20]。

相比之下，亲水相互作用液相色谱（HILIC）在分离极性化合物方面具有显著优势，因为其极性固定相确保了足够的保留能力[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。HILIC的另一个显著优点是它与质谱（MS）的兼容性非常好[21]、[26]。使用低水/高乙腈的流动相已被证明可以显著提高LC/电喷雾离子化（ESI）-MS的检测灵敏度[27]、[28]。自从Alpert引入HILIC以来，专门为HILIC设计的市售和文献报道的固定相数量稳步增加。尽管如此，仍然缺乏一种像C18在RPLC中那样具有广泛应用性的通用HILIC固定相[29]、[30]。在蛋白质组学、代谢组学、天然产物和环境毒理学等快速发展的研究领域，HILIC在分离效率、选择性和可检测分析物范围方面仍面临重大挑战[31]、[32]、[33]。

基于硅胶的HILIC固定相的一个持续挑战是在碱性流动相条件下的水解稳定性有限，而这些条件通常是分析碱性化合物或加速还原糖异构化所必需的。长时间暴露在高pH值下会导致硅胶载体溶解和键合配体的水解，从而导致柱子降解、保留能力丧失以及LC-MS应用中的背景噪声增加。为了解决这一稳定性问题，双齿方法——即设计一种通过多个连接点锚定在硅胶表面的硅烷试剂——已在反相色谱中成功应用。Kirkland等人证明，与传统的单功能固定相相比，双齿硅烷固定相表现出显著增强的水解稳定性，同时保持了单体固定相的高柱效率和可重复的合成特性[34]。作者将这种稳定性的提高归因于每个配体形成的多个硅氧烷键，这减少了水解的敏感性并保护了底层硅胶载体免受氢氧根离子的攻击。随后，这种双齿设计原理被扩展到更广泛的固定相中，证明了其在提高柱子耐用性方面的通用性。最近，双齿概念也被应用于HILIC。Kotoni等人通过一步合成法开发了一系列双齿尿素型HILIC固定相，该方法涉及乙烯二胺与异氰酸酯封端的有机硅烷的反应[35]、[36]。使用固态²⁹Si和¹³C CP/MAS NMR光谱，他们确认了双齿结构的成功固定，并证明这些固定相在碱性条件下表现出优异的水解稳定性，柱子渗漏最小，且数百次注射后的色谱性能稳定。尿素型双齿固定相特别适合糖类分析，其中存在的游离氨基加速了α/β异构体的转化，使得还原糖产生单一的尖锐峰。

尽管取得了这些进展，双齿HILIC固定相的品种仍然有限，人们继续致力于开发结合简单合成、高亲水性、可调选择性和稳健稳定性的新材料。含有季铵的固定相特别适用于HILIC，因为它们具有强亲水性并且能够与极性分析物发生静电相互作用。然而，传统的单齿季铵固定相在碱性条件下通常稳定性有限，并且残余的硅醇活性可能会影响碱性化合物的峰形。在这项研究中，我们报道了一种新型双齿季铵固定相（QAS）的设计、合成和系统评估，用于HILIC应用。QAS固定相具有双齿三乙氧基硅烷结构，旨在通过多个锚定点提供增强的水解稳定性，而季铵基团则赋予了强亲水保留能力和有利的静电相互作用。以单齿二乙氨基型（DAS）和环氧丙氧基型（EPS）固定相为参考，我们系统比较了这些固定相对一系列极性分析物的色谱性能，包括核苷、核碱基衍生物、有机芳香酸和生物碱。在加速的碱性条件下评估了QAS的水解稳定性，并通过系统改变流动相参数探讨了其背后的保留机制。最终，这项工作旨在证明双齿季铵设计为开发具有增强选择性、效率和耐用性的高性能HILIC固定相提供了一种有前景的策略。

材料与试剂

5 μm多孔硅胶（孔径15 nm，比表面积350 m²/g），商业SiO₂柱（颗粒直径5 μm，内径150 mm × 4.6 mm），核碱基衍生物、核苷、苯甲酸衍生物、生物碱、三聚氰胺、Tanaka试剂、烟酰胺、烟酸、吡哆醇由厦门卢家聚新生物技术有限公司（中国厦门）提供。（3-缩水甘油氧基丙基）三乙氧基硅烷和（N,N-二乙基-3-氨基丙基）三甲氧基硅烷购自Adamas Reagent有限公司

表征

表1列出了QAS、DAS和EPS的元素分析结果，证实了成功的键合。实验测得的C:N原子比与理论值相符，进一步证明了整个键合过程的顺利完成。与硅烷反应后硅胶的比表面积、孔径和孔体积的减小进一步证实了键合的成功。QAS的键合密度较低

结论

在这项研究中，通过一种简单高效的方法成功合成了一种新型的双齿季铵固定相（QAS）。在典型的HILIC条件下，QAS固定相对包括核苷、核碱基衍生物、生物碱和有机芳香酸在内的广泛极性分析物表现出优异的分离选择性和对称的峰形。与传统固定相相比，QAS在可调选择性方面具有明显优势

CRediT作者贡献声明

林彩勇：资源提供。程晓东：写作 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资金获取，数据管理。谭凯峰：软件，方法学，实验研究。戴学新：软件，数据管理。李云萍：实验研究，形式分析

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢贵州省科技部门（MS[2025]340项目）和贵州省关键技术研发计划（ZZSG[2024]002项目）的支持。