用于电纺水凝胶中一氧化氮释放过程时间分辨动力学分析的微尺度血红蛋白测定方法

《Analytica Chimica Acta》：Microscale hemoglobin assay for time-resolved kinetic analysis of nitric oxide release from electrospun hydrogels

NO释放监测|微缩血红蛋白测定法|电纺甲壳素凝胶|mesoporous silica nanoparticles|diazeniumdiolate donors

　　

卡罗莱纳·古铁雷斯·西斯内罗斯（Carolina Gutierrez Cisneros）| 大卫·波拉尼亚·梅洛（David Polania Melo）| 维尔莱·布洛门（Veerle Bloemen）| 若昂·皮雷斯（Jo?o Pires）| 莫伊塞斯·平托（Moisés Pinto）| 阿恩·米尼翁（Arn Mignon）

鲁汶大学（KU Leuven），材料工程系（MTM），比利时鲁汶3001

摘要

背景

一氧化氮（NO）从重氮二酯供体中的释放机制在生物材料设计和再生医学领域得到了广泛研究。然而，由于其气态性质、短半衰期和高反应性，NO释放的精确量化仍然具有挑战性。血红蛋白测定法提供了一种直接且按化学计量计算的方法来检测NO，但通常在通量和时间分辨率方面存在局限。在这里，我们将这种测定方法改进为微尺度、多孔板光谱格式，用于监测含有或不含介孔二氧化硅纳米颗粒的电纺甲基化海藻酸盐水凝胶的NO释放情况。

结果

这种微型化的测定方法能够实现24小时内连续、并行地监测NO释放情况，同时减少了试剂消耗。评估了四种重氮二酯供体（商业产品和自主研发产品），浓度为0.05和0.1毫克/毫升，所得到的NO累积浓度约为2-7微摩尔。非线性指数模型（C(t) = A·(1 ? e?(?kt)）显示了与已知重氮二酯分解行为一致的供体特异性释放动力学。未受保护的供体表现出快速初始释放（k ≈ 0.2-0.5 1/小时），而空间保护的类似物则显示出较慢且更持久的释放（k < 0.1 1/小时）。介孔二氧化硅纳米颗粒的加入以供体依赖的方式调节了释放行为。统计分析表明，供体化学性质是决定释放动力学的主要因素，而浓度主要起到缩放作用。

意义

这种微尺度血红蛋白测定方法为生物材料中NO释放的并行、时间分辨量化提供了一个资源高效的平台。它能够在标准化条件下比较不同供体的化学性质和基质效应，从而便于评估用于生物医学应用的NO释放系统。

引言

一氧化氮（NO）是一种双原子自由基，在许多生理过程中充当关键的气体信号分子。尽管它在生物学上非常重要，但由于其在组织中的半衰期短（3-5秒）以及在水环境中快速氧化，直接量化其浓度在生物条件下非常困难。[1]、[2]、[3]、[4] 此外，它与氧气的反应性、低水溶性以及迅速氧化为活性氮物种（如N?O?）限制了其在体内的治疗应用。[5]、[6] 为此，已经开发了多种NO供体用于治疗和研究目的，包括天然存在的和合成的类型。重氮二酯（NONOates）是酶独立的来源，其稳定性和释放特性取决于母胺的化学结构，从而可以实现多样的释放动力学。[3] 重氮二酯具有合成简便、水溶性良好、半衰期可调以及pH依赖性分解的特点，这些特性使其适合用于可控和持续释放NO的递送平台。[3]、[7]

最常见的NO检测技术包括比色法、化学发光、荧光和电化学传感。[4] 然而，由于NO容易氧化为亚硝酸盐（NO??）和硝酸盐（NO??），在生物条件下直接测量非常困难，因此可靠量化仍然具有挑战性。Griess测定法是最常用的比色方法之一，通过量化NO??来进行间接检测。虽然简单且成本低廉，但在微摩尔范围（约0.5微摩尔）以下缺乏灵敏度，并且无法区分NO与其他氮氧化物。[8]、[9]、[10] 荧光探针提供了另一种间接检测方法，虽然具有空间分辨率，但受到pH值、背景信号、光不稳定性和NO中间产物的影响。[4]、[9]、[11]、[12] 相比之下，化学发光可以直接测量气体NO，并提供高灵敏度的时间分辨量化结果，但需要专门的仪器、精确的气体流量和压力控制，并且容易受到干扰。[4]、[10] 因此，一种基于化学计量定义、可通过光谱法进行检测且在水中适合实时测量的方法对于标准化NO释放分析非常有吸引力。

血红蛋白（Hb）测定法通过一种直接且按化学计量定义的方法来检测NO，该方法基于与氧合血红蛋白（HbO?）的明确氧化还原反应，从而实现了定量光谱分析（见补充图S.1）。在HbO?中，铁处于Fe(II)状态，可以与O?发生可逆配位。当NO与血红素中心相互作用时，会将其氧化为Fe(III)，形成 methemoglobin（metHb）和硝酸盐。[14] 这种氧化还原过程会导致明显的光谱位移，这是定量分析的基础。两种光谱在411纳米附近的一个等吸光点相交，该点可用作精确双波长监测的内部参考，从而最小化基线偏差并提高定量准确性。[15]

该反应在生理条件下具有高度特异性和动力学优势，其反应速度比NO的自氧化或其与其他生物分子的反应更快。[16]、[17] 除了精度之外，该测定方法还具有实际优势，支持其在NO释放生物材料研究中的应用。其灵敏度可扩展到低纳摩尔范围，无需使用不稳定的试剂、避免表面污染或专用仪器。[5]、[18] 传统的测定方法通常在毫升级别（3-5毫升）进行，这限制了样本通量、并行化和长期连续动力学监测。

此前已有研究使用Hb测定法监测生物医学环境中的NO释放情况。Murphy和Noack以及L?rfars和Gyllenhammar的早期工作证明了该方法在检测组织、细胞和提取物产生的NO方面的有效性。[15]、[19] 最近，Pinto、Pires及其同事将该测定方法改进用于表征功能化多孔材料的NO释放特性。[10]、[20]、[21] 一项体外研究进一步证明了该方法在监测刺激细胞培养中的NO生成方面的适用性。[22] 总体而言，这些研究支持了该测定方法的稳健性，但也表明在生物材料平台上进行连续、并行和标准化的NO释放分析仍需进一步研究。

为了有效地将NO供体整合到治疗策略中，使用了递送载体。电纺技术是一种多功能制造方法，通过施加高压电场来生产超细聚合物纤维。[23]、[24] 由此产生的电纺水凝胶作为局部NO给药的支架，具有高表面积与体积比、保水性，并能够结合天然和合成聚合物。[25]、[26] 为了进一步提高载药能力和机械强度，可以在电纺纤维中嵌入介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs），这是一种由二氧化硅组成的无机载体，具有可调的孔径（2-50纳米）和极高的表面积（200-1200平方米/克）。[27]、[28]、[29] 它们的多孔结构有助于有效封装小分子，而富含硅醇的表面则改善了分散性和促进细胞相互作用。[25]、[30]

尽管已经探索了许多NO供体用于治疗应用，但在生物材料平台上直接比较它们的释放动力学仍然很少，尤其是在生理相关条件下。现有研究往往依赖于间接或不连续的测定方法，这限制了不同供体和基质组成之间的比较。为了解决这一问题，本研究开发并应用了一种基于血红蛋白的光谱测定方法，采用微型化96孔板格式，实现了对电纺海藻酸盐基水凝胶中NO释放的连续、基于时间的量化。测试了两种配方：甲基化海藻酸盐（AM）和含有介孔二氧化硅纳米颗粒的AM（AM-MSN），并加载了四种重氮二酯（NONOate）供体。包括两种商业产品（二乙醇胺NONOate、DEA-NONOate和二乙烯三胺NONOate、DETA-NONOate）以及两种自主研发的衍生物，包括DETA-NONOate和一种空间保护的di-Boc封端的DETA前体。化学结构见图1。这种方法为复杂生物材料系统中的NO释放比较分析建立了一个标准化的分析平台。

材料

甲基丙烯酸酐（MAA）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，CAS 57-09-0）、正硅酸四乙酯（TEOS，CAS 78-10-4）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，CAS 919-30-2）、乙二醇（CAS 107-21-1）、氨水（25%，CAS 1336-21-6）、聚环氧乙烷（PEO）、Pluronic? F-127、Irgacure 2959（CAS 106797-53-9）、磷酸一钠（CAS 7558-80-7）、磷酸二钠（CAS 7782-85-6）、硼酸钠（CAS 1303-96-4）、亚硫酸钠（CAS 7775-14-6）和冻干的人类...

血红蛋白测定的改进及分析性能

虽然血红蛋白测定法已广泛用于NO的量化，[33]、[40] 但标准协议通常基于比色皿，不适用于微尺度、并行测量格式。在这里，将该测定方法改进为96孔板格式，实现了对直径3毫米的水凝胶盘的局部NO检测和连续的时间分辨测量。

最初使用AM水凝胶和1:150的血红蛋白稀释液进行试验时，反应性较低，因此改用了1:75的稀释比例，并将孔体积定为400微升。

结论

本研究表征了含有重氮二酯供体的电纺水凝胶的NO释放行为，特别强调了开发并应用微型化、基于血红蛋白的光谱测定法进行时间分辨NO量化的重要性。将血红蛋白测定法改进为微尺度格式后，实现了在受控水条件下NO释放的可重复、连续监测，解决了传统比色皿方法的关键局限性。

CRediT作者贡献声明

莫伊塞斯·平托（Moisés Pinto）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、正式分析、概念构思。阿恩·米尼翁（Arn Mignon）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。大卫·波拉尼亚·梅洛（David Polania Melo）：验证、研究、正式分析、概念构思。卡罗莱纳·古铁雷斯·西斯内罗斯（Carolina Gutierrez Cisneros）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、软件使用、项目管理

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突。

数据可用性

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利益冲突声明

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致谢

感谢弗兰德斯研究基金会（FWO Vlaanderen）通过FWO-SB项目（项目编号1S33424N）提供的财政支持，以及用于国外长期停留的旅行补助金V468423N。结构化学中心（Centro de Química Estrutural）是由科学技术基金会（Funda??o para a Ciência e a Tecnologia, I.P./MCTES）通过国家项目（项目编号PIDDAC - UIDB/00100/2020, DOI 10/54499/UIDP/00100/2020和UIDP/00100/2020）资助的研究单位。分子科学研究所（Instituto de Ciências Moleculares）是由FCT通过项目LA/P/0056/2020（DOI 10/54499/LA/P/0056/2020）资助的附属实验室。