《Journal of Avian Biology》：Bridging the gap: improving methodologies for future avian microbiome research
编辑推荐：
这篇综述汇集了鸟类微生物组研究领域的专家见解，旨在为该领域面临的普遍方法学挑战提供系统性解决方案。文章聚焦于野生鸟类微生物组，从宿主生理独特性出发，详述了从野外研究设计、样本采集存储到实验室DNA提取、PCR优化及测序策略的全流程关键考虑因素，并展望了超越物种分类的功能研究、实验方法与多组学整合的未来方向，为相关研究者，特别是新进入者，提供了实用的路线图。
探索鸟类微生物组
鸟类在不同身体区域，如消化道、尾脂腺、皮肤和羽毛，寄宿着复杂的微生物群落，这些群落在其生理、消化和行为中扮演着基础角色。近年来，野生鸟类微生物组研究激增，我们对鸟类-微生物共生体生态进化动力学的理解迅速增长。然而，鸟类的微生物群落如何影响宿主适应和进化，以及它们在不同环境下提供何种功能作用，仍有待探索。虽然野生动物微生物组研究发展迅速，但鸟类微生物组研究面临着许多特有的或常见的挑战。在2023年欧洲鸟类学家联盟大会上，一场圆桌讨论使研究者们得以深入探讨与鸟类微生物组相关的挑战。基于此，本文旨在（1）简要介绍鸟类微生物组区别于其他脊椎动物的独特之处；（2）概述鸟类微生物组领域内常见的方法学挑战（侧重肠道微生物组）；（3）提出应对这些挑战的可能方案；（4）强调需要优化以推动该领域超越简单细菌分类学表征的研究方向。
鸟类宿主-微生物相互作用的独特性
鸟类微生物组在多个方面不同于其他脊椎动物微生物组。比较微生物组研究显示，鸟类物种通常具有物种特异性的微生物群落，与哺乳动物等其他脊椎动物相比，其种内变异更大，时间稳定性更低。因此，在大多数鸟类微生物组研究中，测量的宿主和环境因素只能解释有限的微生物群变异比例。鸟类肠道微生物组变异增加被认为源于与飞行进化相关的较短肠道长度。较短的肠道通常导致更快的肠道保留时间，可能导致肠道环境不稳定和更快的微生物更新。此外，泄殖腔的存在是鸟类与大多数哺乳动物之间的另一个重要生理差异，这是一个泌尿、排泄和生殖系统的共享通道。在泄殖腔中，尿液与粪便混合，降低了总体细菌浓度，因为尿液含有的微生物极少，且含有消化酶和可作为PCR抑制剂的分子，这给DNA提取和最终肠道与生殖微生物组表征带来了方法学挑战。
与哺乳动物相比，卵生可能限制了肠道微生物的代际垂直传播。尽管如此，有证据表明微生物可通过皮肤、羽毛、卵内和鸟巢传播给后代。不同的繁殖策略，如巢寄生、合作、集群或双亲抚育，也影响鸟类微生物组的早期发育。宿主的免疫系统在检测和启动对微生物的响应中起重要作用，鸟类的免疫系统成分与哺乳动物不同，例如存在法氏囊、不同的免疫细胞库和抗体，这些差异在与微生物的相互作用中至关重要。最后，鸟类表现出高度的活动性，约一半的物种具有迁徙习性，这使个体在年周期中暴露于多种栖息地和相关的微生物群落，导致微生物群的年内变化，也给微生物组采样带来了挑战。
方法学挑战：从野外到实验室
在野外
- •
研究设计：在开展鸟类微生物组研究之前，需进行多种方法学和技术考量，最重要的是根据所提问题量身定制实验设计和采样策略。笼养实验允许对实验设计进行更大控制，减少潜在的污染源或协变量，并能进行有启发性的操纵实验。然而，笼养排除了自然相互作用的复杂性。相比之下，基于野外的研究允许识别影响微生物组的宿主或环境协变量，因此具有更大的生态和进化相关性。使用巢箱种群可以促进野外实验操作，但使用巢箱种群存在局限性，包括研究物种有限，以及所获见解是否能推广到非洞巢物种。因此，结合野外和笼养方法将增强我们更好地评估因果关系同时考虑现实情况的能力。纵向数据收集在鸟类物种中尤为重要，因为鸟类微生物群落具有较高的时间变异性。对个体进行重复采样（包括技术和采样重复）对于正确厘清不同混杂因素对鸟类微生物组的作用至关重要。其他一般考虑因素包括考虑昼夜和季节节律、换羽周期、迁徙阶段和繁殖阶段，因为不同的物候事件会对鸟类微生物组产生下游影响。此外，采样年龄和频率需要根据研究问题调整。目前，大多数鸟类微生物组研究以细菌部分为目标，但需记住，虽然细菌占大多数，其他微生物群落如古菌组、病毒组/噬菌体组、真核生物组（包括真菌组）和原生生物可能也扮演重要角色，需要这些数据才能获得微生物组的完整代表性概览。
- •
样本采集：选择采样方法时，应考虑下游应用、物种生理学、压力管理和体型大小。鸟类肠道微生物组数据采集有四种常用方法。粪便样本是最常用的方法，适用于小型鸟类的标准化方法已有描述。另一种方法是使用机会性粪便采集/拭子法。泄殖腔拭子或冲洗是另一种选择。对于泄殖腔微生物组采样，可以使用无菌的植绒拭子。有研究显示泄殖腔的微生物群落与粪便中的不同。泄殖腔冲洗有时也被用于采样肠道微生物组，尽管尚无比较研究评估其准确性。破坏性采样（如对个体实施安乐死，或从碰撞死亡的个体或博物馆获取样本）仍然是准确捕获胃肠道上部细菌群落最可靠的方法，但存在伦理考量，且仅能提供横断面数据。除肠道外，鸟类其他身体部位的微生物组也可能具有研究价值，如尾脂腺、呼吸道、羽毛、皮肤、蛋壳表面和鸟巢本身的微生物组。
- •
样本存储：样本收集后，其储存和运输需要仔细考虑，以避免细菌生长并确保DNA完整性。储存方法将根据目标微生物群落、研究问题和后勤限制而变化。研究内部储存方法的一致性对于最小化方法学偏差至关重要，而研究间的标准化将提高可比性并促进稳健的荟萃分析。通常，微生物组样本的黄金标准是新鲜样本立即在低温下储存，这种方法被广泛认为在保存微生物组成、抑制微生物生长、防止DNA降解和确保结果高重复性方面有效。根据下游目标，样本储存可能需要额外的处理。然而，野外条件往往带来重大限制，需要替代存储策略，如短期冷藏、使用硅胶珠干燥样本，或添加简单的保存缓冲液。不同的保存缓冲液会对微生物组成产生一定影响，这使标准化保存方案的建立进一步复杂化。
在实验室
- •
提取过程：一旦收集了微生物组样本，就需要做出与其处理相关的明智决策。第一步是确定合适的DNA提取方法，并评估其是否适合下游处理。不同的DNA提取方法产生不同数量、质量和长度的gDNA分子。建议在研究内部保持所有方法一致，并在同一时期和实验室提取所有样本，以尽量减少技术变异。与鸟类微生物组样本处理相关的一个常见问题是微生物DNA产量低，这通常归因于鸟类粪便样本中存在PCR抑制剂和DNase。为了提高微生物产量，一些研究优先使用粪便样本的棕色部分，和/或将样本吸印在无菌滤纸上以减少白色尿酸。如果样本储存在乙醇中，在DNA提取前去除所有乙醇很重要。预处理优化，如增加消化孵育时间，或在珠磨前增加一个65°C加热步骤，可以有所帮助。在DNA提取前，另一个重要方面是在每个步骤包含阴性对照，以检测收集方法、材料或所用试剂中的潜在污染物。对于大量样本测序，建议在不同的板或测序批次中包含重复样本，以考虑技术批次效应。
- •
PCR方法：为测序准备鸟类微生物组样本，可以选择将gDNA送往商业实验室进行文库构建，也可以在内部进行。虽然外包这些实验室步骤可能更省时，但商业实验室通常不允许修改其流程，这种不灵活性对于可能需要调整才能获得最佳结果的鸟类微生物组样本尤其成问题。一个常见的PCR优化是增加PCR循环数。样品中PCR抑制剂的存在也可能影响PCR扩增。在某些情况下，稀释gDNA可以提高PCR效率。进行qPCR可以帮助确定最佳PCR循环数并检测潜在抑制剂。来自饮食或宿主的DNA可能进一步主导测序结果，不过这些可以在计算上被移除。然而，如果这些问题造成重大困扰，可以采用PNA-DNA夹或一步PCR法等方法来减少不需要的序列的扩增。进行微生物组宏条形码测序时的其他考量包括基因区域的选择、方案修改、测序仪器和潜在的批次效应。最常见的目标细菌群落的基因组区域是16S核糖体rRNA基因的V4区，以及V3-V4区。
测序策略
扩增子研究通常利用第二代短读长测序平台，这些技术以相对较低的每个样本成本产生高精度数据，但很少能将物种分类解析到属以下水平，并且区分近缘类群的能力有限。另一种方法是使用短读长平台进行鸟枪法宏基因组学，该技术避免了扩增子扩增偏差，但通常需要更高的DNA量、更高的每个样本成本以及更先进的生物信息学分析。然而，这种方法迄今应用于野生鸟类物种具有挑战性，例如从鸟类微生物组样本中获取高质量的宏基因组组装基因组尤为困难。第三代长读长平台可以测序全长的基因或感兴趣的基因组区域，从而提高物种和菌株水平的解析度，但错误率较高，需要完整和高浓度的gDNA。目前，这种方法在鸟类微生物组研究中的应用很少。无论选择哪种技术，在单个研究中使用相同的技术以尽量减少样本间的技术偏差至关重要。
序列数据库
该领域面临的一个系统性挑战是微生物分类群的分类。当前的细菌数据库主要基于家养动物和人类的细菌共生体，因此我们无法表征野生动物微生物组的真实分类学多样性。由于宿主相关微生物组研究严重偏向哺乳动物宿主，这种偏倚在鸟类微生物组研究中被特别放大。目前的鸟类研究主要使用SILVA和greengenes2数据库进行16S宏条形码测序。对于非细菌和非扩增子测序的鸟类微生物组样本，数据库使用较不规范。
超越分类学表征
虽然研究宿主体内微生物的分类学多样性揭示了宝贵的见解，但这种多样性的功能相关性仍不清楚，尤其是在鸟类宿主中。事实上，几种不同的微生物分类群可以为宿主提供相似的功能，而密切相关的微生物分类群可能具有非常不同的功能。因此，鸟类微生物组领域需要超越量化分类学变异，以更好地理解这种多样性的后果。
- •
细菌丰度定量：所有基于计数的测序方法的一个局限性是测序数据的组成性。因为只测量相对比例，所以无法通过计数读数准确估计绝对丰度。然而，已提出几种在非鸟类样本中测试过的方法来实现更好的微生物负荷量化，例如添加已知数量的外源DNA，或在测序前采用定量/数字微滴PCR方法。另一种有前途的方法是简单地将读数标准化，然而，由于鸟类的宏基因组数据通常包含的微生物比例远低于非飞行动物，这种方法在鸟类研究中是否可行尚不清楚。
- •
微生物功能：为了更深入地了解鸟类微生物共生体的作用，我们需要超越多样性和分类组成的估计。功能数据可以通过各种组学方法获得，如宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学。一种有前景的策略是，对选定的少量样本进行深度长读长鸟枪法宏基因组学以更好地组装完整的MAGs，然后对大量样本进行浅度鸟枪法宏基因组学以估计微生物基因的相对丰度。结合宿主基因组将特别有用。另一种方法可以是通过使用基于分类学的程序从更大的宏条形码数据集中粗略推断功能数据，然而，仅依赖基于分类学分配预测的功能存在权衡，因为功能估计很大程度上基于模式生物的微生物。虽然宏基因组方法可以提供微生物组的功能潜力，但它们不显示采样时哪些基因正在表达。宏转录组测序允许估计微生物的基因表达，并加深我们对微生物组对其宿主功能贡献的了解，例如特定分类群的重要性。不过，宏基因组和宏转录组方法没有考虑可能改变微生物蛋白功能的翻译后修饰。相反，基于质谱的宏蛋白质组分析能够检测所有群落成员在特定时间点产生和修饰的蛋白质。代谢组学方法表征样本中的代谢物谱，尽管粪便代谢组包括宿主和微生物代谢物，但大部分似乎来源于微生物。代谢组学已被初步应用于少数野生鸟类物种，表明循环代谢物谱反映了环境条件。一种相对经济高效的方法是对关键微生物代谢物进行定量分析。由于经济价值，更多研究使用上述组学方法来表征家禽的微生物组，揭示了特定的微生物功能。因此，野生动物研究人员在家禽研究结果的基础上，采用可转化为非模式鸟类物种的有用方法将很重要。
- •
实验方法：实验方法可以提供因果和机制性的理解，以及对特定微生物生物学相关性的见解。这些实验可以在一定程度上在野外进行，例如交叉抚育雏鸟等操纵实验。此外，行为实验，如认知测试，对于广泛理解肠-脑轴很有价值。而圈养和实验室实验允许对协变量进行更大控制。直接影响肠道微生物组的实验方法示例包括粪便移植、饮食、益生菌、特定微生物菌株或通过抗生素处理破坏微生物组。
- •
整合数据集以获得更深入的见解：采用全基因组学方法（将宿主基因组数据与微生物组数据相结合）对鸟类物种尤为必要。在野生鸟类中，仅有一项研究探讨了宿主基因组与其肠道微生物群之间的关联。然而，有几个鸟类研究案例探讨了微生物组与宿主全基因组杂合性或特定免疫基因之间的关联。将其他遗传数据集，如饮食宏条形码，与微生物组数据整合是确定高分辨率饮食变异在多大程度上与微生物组变异一致，并进一步研究塑造鸟类肠道微生物组的环境因素的好方法。然而，整合饮食和微生物组宏条形码的研究迄今表明两者之间相关性很小，尽管特定的饮食项目与某些细菌类群的丰度有关。此外，鸟类特定的数据共享网络有助于促进跨研究组的样本收集和协作。
展望未来
最后，目前正在利用人类和小鼠模型开发的新技术可能对未来的鸟类微生物组研究有用。例如，用于捕获整个消化道群落的微生物组胶囊，以及培养组学。微生物的单细胞测序方法有助于更局部、更精细地了解其活动。同样，合成类器官的开发使得能够详细理解宿主-微生物相互作用的机制。在鼠类和昆虫中，无菌和悉生实验动物是获取微生物如何影响表型和宿主适应度的因果理解的有价值的研究系统。自20世纪50年代以来，类似方法已用于家禽。进一步开发无特定病原体和悉生鸟类系统的方法学将提高我们更好地理解鸟类-微生物相互作用的机制原因的能力。
结论
在研究鸟类肠道微生物组时，方法学一致性至关重要，因为多项研究表明，采样、存储和处理选择可能会给结果带来显著变异。因此，我们作为研究人员必须在整个研究过程中保持一致的方案，同时也要意识到所选方法的固有局限性和潜在偏差。为了确保数据质量，纳入对照样本并仔细记录与采样和处理相关的所有背景信息至关重要。需要在多个层面考虑可重复性。此外，需要仔细的污染控制。短读长扩增子测序仍然是高通量、高性价比输出的黄金标准。尽管如此，我们需要通过应用鸟枪法宏基因组学和宏转录组学来获取微生物群落的功能见解，同时利用长读长平台向物种级精度推进，从而进一步推动鸟类微生物组领域的发展。然而，这些方法对鸟类样本带来了重大挑战。如今，鸟类微生物组进行鸟枪法宏基因组和第三代测序的主要障碍是微生物DNA产量低、片段短，以及宿主污染比例大。展望未来，我们需要创新的方法学研究来提高鸟类样本中的微生物DNA产量和/或去除宿主DNA及PCR抑制剂。进一步加深我们对鸟类微生物组的理解需要一个更广阔的视角，不仅包括肠道细菌群落，还包括真菌和病毒等微生物成员，以及鸟类不同身体区域的微生物组。与领域内的其他研究者进行公开交流，无论是在遇到挑战时还是在项目规划期间，都有助于确保研究的稳健性和可比性。最后，我们主张在鸟类系统发育树上进行更全面、更具比较性的纵向研究，并理想地结合微生物潜在环境来源的特征分析，以提供对鸟类-微生物相互作用更深入、更全面的视角。
