《npj Breast Cancer》：Investigating the contribution of rare non-coding variants in BRCA1, BRCA2 and PALB2 to hereditary breast cancer
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BRCA1、BRA2和PALB2的致病性编码变异是遗传性乳腺癌/卵巢癌的已知风险因素，但这些区域仅占基因基因组足迹的不到10%，大部分序列未被探索。本研究在包含超过11,000名参与者的BEACCON病例-对照研究中，通过分析BRCA1、BRCA2和PALB2的内含子变异和5′上游区域，探究了非编码变异对遗传性乳腺癌的贡献。全基因测序显示，46.3%的病例携带至少一种罕见非编码变异，这与乳腺癌风险的小幅增加相关(OR=1.2, p<0.0001)。在三阴性乳腺癌中观察到更强的富集，尤其在BRCA1中(OR=1.5, p=0.0001)。对42个高优先级变异的肿瘤测序发现，26.2%的变异存在野生型等位基因丢失和高同源重组缺陷。在MCF10A细胞中进行的CRISPR/Cas9基因敲入功能实验证实，两个深度内含子变异产生了异常剪接位点，破坏了剪接并影响了转录本表达。
在探索遗传性乳腺癌的根源时，科学家们的目光早已锁定在几个明星基因上，其中BRCA1、BRA2和PALB2尤为突出。众所周知，这些基因中存在的一些“编码变异”——也就是那些能够直接改变最终蛋白质结构的遗传密码错误——会显著增加个体患乳腺癌和卵巢癌的风险，这也是安吉丽娜·朱莉等公众人物进行预防性手术的遗传学依据。然而，一个长期被忽视的“暗物质”领域正逐渐浮出水面：基因的庞大序列中，只有不到10%是负责编码蛋白质的区域，而超过90%是非编码区域。这些非编码区域像是一本巨著的“注释”和“排版指令”，虽然不直接构成“正文”（蛋白质），却对基因如何被正确“阅读”（表达和调控）至关重要。那么，一个核心问题摆在了研究人员面前：除了那不到10%的编码区，在BRCA1、BRA2和PALB2基因广阔的非编码区域中，那些罕见的遗传变异，是否也在遗传性乳腺癌的发生中扮演了被低估的“推手”角色？目前，我们对这块“暗物质”领域的了解几乎是一片空白。
为了回答这个问题，一个国际研究团队在《npj Breast Cancer》上发表了一项重要研究。他们开展了一项名为BEACCON的大规模病例-对照研究，囊括了超过11,000名参与者。研究人员将目光投向了BRCA1、BRA2和PALB2基因的非编码区域，特别是内含子（基因中不编码蛋白质、在RNA剪接中被移除的部分）和基因起始端上游的调控区域（5′上游区域）。他们的目标很明确：系统性地探究这些区域的罕见变异是否与遗传性乳腺癌风险相关，并从中找出可能具有致病性的“罪魁祸首”。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。首先是全基因测序，对目标基因的编码和非编码区进行完整的序列解读，这是发现所有变异的前提。其次，他们构建并分析了BEACCON这一大型病例-对照队列，为统计关联分析提供了人群基础。在发现潜在的致病性变异后，他们利用肿瘤样本测序来观察变异在肿瘤中的分子特征，例如野生型等位基因是否丢失以及是否存在同源重组缺陷(HRD)。最后，为了在功能上验证变异的影响，他们采用了精准的CRISPR/Cas9基因编辑技术，在MCF10A人乳腺上皮细胞系中进行基因敲入实验，模拟人体内的变异，从而观察其对基因剪接和表达的具体影响。
研究结果揭示了非编码变异在乳腺癌风险中的复杂图景：
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罕见非编码变异广泛存在且与风险微弱相关：通过全基因测序，研究人员发现，高达46.3%的乳腺癌病例携带至少一个BRCA1、BRCA2或PALB2基因的罕见非编码变异。统计分析显示，携带任何罕见非编码变异与乳腺癌总体风险的小幅但显著升高相关，比值比(OR)为1.2。这表明，在大量可能中性的变异背景中，隐藏着一小部分真正具有致病性的变异。
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风险关联在特定亚型中增强：当聚焦于更具侵袭性的三阴性乳腺癌(TNBC)时，风险关联性显著增强，尤其是在BRCA1基因的非编码变异中，其OR值达到1.5。这提示非编码变异可能在某些乳腺癌亚型的发生中作用更为突出。
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从众多变异中筛选出高优先级候选者：研究从海量变异中筛选出42个“高优先级”变异进行深入分析。对这些变异所在的肿瘤样本进行测序发现，其中11个（占26.2%）变异表现出明确的致病性分子特征：对应的野生型（正常）等位基因丢失，并且肿瘤表现出高水平的同源重组缺陷(HRD)。HRD是BRCA1/2相关乳腺癌的一个关键标志，表明DNA修复机制失灵。
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功能实验证实致病机制：为了提供最直接的证据，研究人员利用CRISPR/Cas9技术，将两个位于基因深处（深度内含子）的候选变异分别引入MCF10A细胞。功能实验证实，这两个变异确实创造了新的、异常的剪接位点，导致正常的基因剪接过程被破坏，并最终影响了正常转录本（mRNA）的表达水平。这从机制上证明了这些非编码变异可以通过干扰RNA剪接来导致基因功能失常。
研究结论与讨论：
这项研究系统地评估了BRCA1、BRCA2和PALB2基因中非编码罕见变异对遗传性乳腺癌的贡献。主要结论是，虽然大多数罕见非编码变异可能是中性的，但其中确实存在一小部分具有致病性的变异，它们共同贡献了可测量的、虽然整体上较为微弱的乳腺癌风险增加，这种风险在三阴性乳腺癌等亚型中更为明显。更重要的是，研究通过结合肿瘤分子谱分析和细胞功能实验，成功地从大量变异中鉴别并验证了少数可通过破坏RNA剪接来发挥作用的致病性非编码变异。
其重要意义在于，这项研究首次在大规模人群中揭示了乳腺癌易感基因非编码区域“暗物质”的贡献，拓宽了我们对遗传性乳腺癌遗传基础的理解。它表明，未来的遗传咨询和基因检测可能需要考虑将特定的非编码区域纳入分析范围，以更全面地评估个体的患病风险。同时，研究建立了一套从群体关联分析到分子机制验证的完整研究范式，为探索其他复杂疾病中非编码变异的致病性提供了可借鉴的蓝图。当然，研究者也指出，已鉴定的致病性变异只是冰山一角，更多非编码变异的临床意义和功能机制仍有待进一步探索。这项研究如同在广阔的遗传暗物质星图中点亮了几颗重要的星辰，指引着未来更深入探索的方向。
