《Insects》：The Development of Eupyrene Sperm Is Dependent on Sperm-Leucylaminopeptidase in Bombyx mori
Hongxia Kang,
Guan Man,
Yutong Liu,
Anjiang Tan and
Kai Chen
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本研究通过 CRISPR/Cas9 技术敲除家蚕睾丸特异表达的 BmS-LAP 基因，首次揭示其在鳞翅目昆虫二型精子发生中的关键作用。研究人员发现，BmS-LAP 缺失导致雄性家蚕完全不育，具体表现为有核精子（eupyrene sperm）的核定位异常和鞭毛伸长失败，而无核精子（apyrene sperm）发育正常。这项研究不仅证实了 BmS-LAP 对有核精子发育至关重要，也为鳞翅目昆虫雄性不育的分子机制提供了新见解。
在许多昆虫，尤其是蝴蝶和蛾子（鳞翅目昆虫）中，雄性的“造精”过程别具一格。它们不像大多数生物那样只生产一种精子，而是会同时制造两种外观和功能都大相径庭的精子：一种是有细胞核、负责与卵子结合完成受精的“正规军”——有核精子（eupyrene sperm）；另一种则是没有细胞核、被认为在协助精子竞争和迁移中起辅助作用的“勤务兵”——无核精子（apyrene sperm）。这种独特的“二型精子发生”现象一直是发育生物学中有趣的谜题，但调控这两种精子分化和发育的关键分子机制，科学家们仍知之甚少。
与此同时，亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidases, LAPs）作为一类能切割蛋白质N端亮氨酸的酶，在哺乳动物和双翅目昆虫（如果蝇）的雄性生殖中被发现与生育力密切相关。然而，这类酶在鳞翅目昆虫的雄性生殖，特别是在其独特的二型精子发生过程中，究竟扮演什么角色，完全是一个未知的领域。为了回答这个问题，一组科学家以鳞翅目模式昆虫——家蚕（Bombyx mori）为研究对象，开展了一项探索。
家蚕作为一种重要的经济昆虫和遗传操作技术成熟的模式生物，是研究这一问题的理想材料。研究人员将目光锁定在家蚕中唯一一个与果蝇睾丸特异性亮氨酸氨基肽酶（Sperm-Leucylaminopeptidase, S-LAP）同源的基因上，并将其命名为 BmS-LAP。他们想知道：BmS-LAP 在家蚕中是否也特异性地在睾丸表达？如果敲除这个基因，会对家蚕，特别是雄性的生育能力产生什么影响？这种影响是作用于两种精子，还是只针对其中一种？背后的分子机制又是什么？为了揭开这些谜团，研究人员进行了一系列严谨的实验。
这项研究最终发表在国际期刊《Insects》上。论文的发现不仅确认了一个调控家蚕有核精子发育的关键基因，也为理解鳞翅目昆虫独特的生殖策略提供了重要的分子线索。
关键研究方法简述
研究人员主要采用了以下几种关键技术：1. 利用二元转基因 CRISPR/Cas9 系统构建 BmS-LAP 基因敲除的家蚕突变体（ΔBmS-LAP）。2. 通过实时定量 PCR（qRT-PCR）分析了 BmS-LAP 基因在不同组织和发育时期的表达模式。3. 使用苏木精-伊红（H&E）染色和荧光染色（用TRITC标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白，Hoechst标记细胞核）技术，对野生型和突变体家蚕睾丸、精子束以及雌雄生殖道中的精子进行形态学观察和比较。4. 通过连续交配实验，评估了突变体无核精子的功能。5. 对突变体和野生型家蚕的睾丸组织进行RNA测序（RNA-seq）分析，并结合qRT-PCR验证，筛选差异表达基因并进行功能富集分析。6. 测定了精子中的三磷酸腺苷（ATP）含量。研究所用的家蚕品种为多化性、不滞育的Nistari品系。
研究结果分析
3.1. BmS-LAP 的表达模式与突变体构建
研究人员首先确认，与果蝇中的 S-LAPs 类似，BmS-LAP 在家蚕中也呈现睾丸特异性表达模式，且在幼虫发育后期至蛹期和成虫期持续高表达，提示其可能对睾丸发育至关重要。随后，他们利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建了 BmS-LAP 基因敲除突变体，并通过测序和qRT-PCR证实了基因的突变和表达量显著降低。
3.2. BmS-LAP 缺失导致雄性不育
尽管 BmS-LAP 突变体在生长发育阶段没有表现出明显的异常，但交配实验显示，突变体雄性家蚕完全丧失了使雌性产下可孵化后代的能力，即表现为完全的雄性不育，而突变体雌性的生育力则不受影响。组织切片观察发现，突变体睾丸中精子发生过程逐渐停滞，特别是在幼虫发育后期，突变体睾丸中只能看到圆形的精母细胞囊和短小的精子束，而野生型中则已出现大量伸长的有核精子束。
3.3. BmS-LAP 突变损害有核精子的形成
通过荧光染色进一步观察精子束的细节，研究人员发现，在野生型中，有核精子束从幼虫早期开始伸长，细胞核逐渐凝集并聚集在束的头部，最终形成具有长鞭毛和紧密核头的成熟精子束。而在突变体中，有核精子束的伸长过程在启动后逐渐被破坏并最终停滞。突变体的有核精子束显著更小，形态异常，细胞核凝集和聚集也发生障碍，导致成虫期的有核精子束结构塌陷，表现为鞭毛缩短、细胞核分散。相比之下，突变体无核精子的发育、细胞核的消除和个体化过程均未观察到明显缺陷。这表明 BmS-LAP 对有核精子的发育至关重要，但对无核精子的形成是非必需的。
3.4. 突变体有核精子的迁移受阻
精子成熟后，会从睾丸释放并迁移到雄性生殖道，最终在交配时转移到雌性体内。研究人员检查了生殖道中的精子情况，发现在野生型雄性的射精管中，同时存在个体化的无核精子和成束的有核精子，而突变体雄性射精管中只能检测到无核精子。同样，在与突变体雄性交配后的雌性交配囊和受精囊中，也只发现了无核精子，未见有核精子。这说明 BmS-LAP 的缺失特异性损害了有核精子的迁移，对无核精子无影响。为了进一步验证突变体无核精子的功能是否完好，研究人员进行了双重交配实验。他们让雌性家蚕先后与完全不能生育的 BmS-LAP 突变体雄性和另一种无核精子异常但拥有正常有核精子的 BmSxl 突变体雄性交配。结果显示，这种连续交配能部分恢复后代的孵化率，证明 BmS-LAP 突变体的无核精子在功能上是正常的，能够辅助来自 BmSxl 突变体的有核精子完成受精。
3.5. BmS-LAP 突变体的转录组分析
为了从分子层面探究 BmS-LAP 缺失导致精子发生缺陷的机制，研究人员对突变体和野生型家蚕的睾丸进行了RNA测序分析。他们发现了605个显著差异表达的基因。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些差异基因显著富集于能量代谢相关通路，如碳水化合物代谢过程、N-聚糖生物合成、果糖和甘露糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等。qRT-PCR验证也证实了这些通路中多个基因的表达紊乱。与此一致，突变体精子中的ATP含量也显著降低。这些发现表明 BmS-LAP 的缺失扰乱了精子发生所需的能量代谢。此外，RNA-seq数据显示，鞭毛内运输（Intraflagellar Transport, IFT）复合体B中的一个关键基因 IFT46 在突变体中表达显著下调。IFT复合体B负责将鞭毛组件从细胞体正向运输到组装位点，其功能障碍会导致精子鞭毛形成缺陷。qRT-PCR检查其他IFT-B复合体相关基因的表达，发现 IFT46 和 IFT52 表达下调，而 IFT20 和 IFT22 表达上调，表明IFT-B复合体的功能紊乱。这为突变体中有核精子鞭毛伸长失败的表型提供了可能的分子解释。
研究结论与意义
本研究首次在家蚕中证明了睾丸特异性表达的亮氨酸氨基肽酶基因 BmS-LAP 在二型精子发生中的关键作用。BmS-LAP 的缺失会导致家蚕雄性完全不育，但这种不育是特异性的——它只严重影响有核精子的发育，导致其细胞核定位异常和鞭毛伸长失败，而对无核精子的形成和功能没有显著影响。
这项研究的重要意义在于：首先，它填补了LAPs在鳞翅目昆虫雄性生殖中功能研究的空白，将LAPs与生育力的关联从哺乳动物和双翅目昆虫扩展到了鳞翅目。其次，研究揭示 BmS-LAP 特异性地调控有核精子发育，这为理解鳞翅目昆虫独特的二型精子发生的分子调控机制提供了全新的视角和关键基因靶点。最后，转录组分析将 BmS-LAP 的功能与能量代谢通路（如糖基化、糖代谢）和鞭毛组装相关基因（如IFT基因）的表达失调联系起来，提出了 BmS-LAP 可能通过影响精子发生过程中的能量供应和细胞骨架重组来发挥作用的新假设。这为深入解析精子发育的代谢调控和形态建成的复杂网络奠定了基础。
论文在讨论部分指出，在果蝇中，S-LAP蛋白的功能可能独立于其经典的氨基肽酶活性。因此，未来研究需要进一步阐明 BmS-LAP 的具体蛋白底物，并确定其是否通过其亮氨酸氨基肽酶活性来行使其功能。总之，这项工作不仅揭示了 BmS-LAP 是调控家蚕有核精子成熟的关键因子，也暗示了代谢调控与细胞骨架形态发生在精子发育过程中的潜在联系。
