羽毛、羊毛、头发和指甲等角蛋白废弃物在禽类和皮革工业中产生量巨大[1]。由于角蛋白结构的高度交联，使其难以被常规蛋白酶分解，这些废弃物中的蛋白质资源尚未得到充分利用[2]。微生物产生的角蛋白酶（EC 3.4.-.-）是一种专门的蛋白酶，能够分解角蛋白并将其转化为可溶性肽和氨基酸[3]。这种酶为废物转化、动物饲料生产以及生物技术应用（如皮革加工、洗涤剂制备和肽合成）提供了更环保的途径[4]。最近的研究强调了角蛋白酶的巨大工业潜力，以及通过蛋白质工程和工艺优化提高其活性和稳定性的研究进展[2],[4],[5]。
对于需要高温或恶劣操作条件的工业过程来说，耐热且稳定性强的角蛋白酶尤为重要[6]。通常从温泉等地热环境中分离出的嗜热和耐热细菌是这类酶的重要来源，因为它们的蛋白质在较高温度下仍能保持良好的热稳定性和活性[7],[8],[9]。对印度喜马拉雅温泉及全球地热区域的调查表明，温泉是多种嗜热细菌的栖息地，其中许多细菌携带多种具有工业价值的酶，包括蛋白酶和角蛋白酶[10],[11],[12]。因此，对地热区域进行采样是发现具有理想生化特性的新型角蛋白酶菌株的有效方法。
与Bacillus属相关的细菌是最常报道的角蛋白酶生产者之一；在近期研究中，Bacillus paralicheniformis被证明是一种具有高蛋白分解活性的强效角蛋白酶，适用于羽毛降解和其他生物过程[13]。新鉴定的B. paralicheniformis菌株表现出良好的角蛋白酶产量和适宜的生化特性，使其成为下游优化和规模扩大的理想候选菌种[14]。
在分子层面，细菌角蛋白酶主要属于丝氨酸蛋白酶家族，其特征是具有保守的催化三联体（Ser–His–Asp），该结构负责肽键的水解[15]。角蛋白的分解过程通常分为两个步骤：（i）通过微生物还原剂或辅助酶还原角蛋白的二硫键，使其结构变得松弛；（ii）随后由角蛋白酶对多肽骨架进行水解[16]。与非角蛋白酶丝氨酸蛋白酶相比，角蛋白酶具有更大的底物结合口袋和暴露在表面的残基，这有助于其与高度交联和疏水性的角蛋白结构有效结合[17],[18]。早期的突变研究表明，底物结合口袋的变化会影响酶的催化活性和底物选择性。然而，极端环境下的角蛋白酶表现出更高的活性和稳定性，这归因于多种结构适应性改变，包括改进的疏水相互作用、优化的自我桥接网络以及表面灵活性的提升[19],[20]。
优化发酵和培养条件对于提高角蛋白酶产量并确定后续规模化生产的操作参数至关重要。实验的统计设计，特别是响应面法（RSM）及其相关设计（如Box–Behnken和Central Composite设计），被广泛用于量化因素间的相互作用、高效确定最佳条件并提供过程控制所需的预测模型[21],[22]。最近的角蛋白酶研究通常结合RSM与验证实验和可行性分析，以确定温度、pH值、培养时间和通气/搅拌条件的最佳组合，从而提高酶的生产效率[21]。
本研究从印度北阿坎德邦甘加纳尼温泉中分离出一种角蛋白酶产生菌GS3，鉴定为Bacillus paralicheniformis SuvM（JBQZRG000000000），并利用Box–Behnken RSM设计对其角蛋白酶生产过程进行了优化。本研究整合了分子鉴定、粗酶特性分析以及基于RSM的工艺参数优化（温度、pH值、培养时间和搅拌速度），并通过可行性分析验证了优化效果。通过利用来自喜马拉雅温泉的耐热Bacillus菌株并应用现代优化技术，本研究旨在开发一种高产量的工业用角蛋白酶生产工艺，并扩充可用于生物技术的角蛋白酶资源库。
