《Entomological Research》：Development of Isothermal Amplification Assays for the Identification of Spodoptera eridania and Spodoptera ornithogalli (Lepidoptera: Noctuidae) Using Mitochondrial Gene Sequences
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为解决入侵性害虫南方粘虫(SAW)和黄条粘虫(YSAW)快速精准现场检测的难题，研究人员基于线粒体COI基因序列，成功开发了环介导恒温扩增(LAMP)检测方法。该方法可在25分钟内利用粗提DNA对目标物种进行特异性识别，为这两种重要检疫性害虫的早期监测与防控提供了强有力的现场诊断工具。
在全球化贸易日益频繁的背景下，外来入侵物种的扩散风险不断加剧，对各国农业生产和生物安全构成了严重威胁。其中，隶属于夜蛾科(Noctuidae)粘虫属(Spodoptera)的南方粘虫(Spodoptera eridania, SAW)和黄条粘虫(Spodoptera ornithogalli, YSAW)便是两种极具破坏力的潜在入侵者。这两种害虫以其幼虫集群取食的“行军虫”习性闻名，食性极广，可危害豆类、番茄、甘蓝、洋葱、大豆等多种重要经济作物，一旦入侵定殖，将造成巨大的经济损失。尽管韩国等地尚未正式报道其入侵，但其已在非洲、印度等地扩散，并曾在日本、荷兰等地因农产品贸易而被截获，敲响了潜在的入侵警钟。因此，韩国等国已将其列为重要的检疫性害虫。面对这样的威胁，关键在于“早发现、早处置”。然而，传统的形态学鉴定需要对复杂的生殖器结构进行精细观察，操作繁琐且对虫体完整性要求高，不适用于田间大批量、快速筛查。现有的一些分子诊断技术，如DNA条形码、实时荧光定量PCR(PCR)等，虽然准确，但通常需要专业实验室和设备，耗时较长，难以满足入境口岸或田间现场的即时诊断需求。为了填补这一技术空白，一项旨在开发快速、准确、适用于田间现场操作的诊断新方法的研究应运而生，其成果发表于期刊《Entomological Research》。
研究人员主要运用了几项关键技术。首先，他们对目标物种SAW、YSAW及一种非目标物种(S. praefica)进行了完整的线粒体基因组(Mitogenome)测序，并结合公共数据库中已有的11种鳞翅目昆虫的线粒体基因组进行比对分析。基于此，他们优先从线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因中筛选出具有物种特异性变异区域的序列。接着，利用环介导恒温扩增(LAMP)技术，为SAW和YSAW分别设计并优化了特异性引物组。最后，他们系统地验证了所开发LAMP方法的特异性、灵敏度以及对粗提DNA的适用性，并优化了反应温度和时间等条件参数。研究中使用的样本包括在美国采集的目标物种SAW、YSAW、S. praefica，以及在韩国利用性信息素诱捕器或灯光诱捕器采集的多种非目标粘虫属及其他鳞翅目害虫。
3.1 物种鉴定
在开展研究前，已通过外部形态检查和DNA条形码测序对所有样本进行了准确鉴定，确保了后续分析所用材料物种身份的正确性。
3.2 线粒体基因组基本特征
研究成功测定了SAW、YSAW和S. praefica的完整线粒体基因组，其大小分别为15,507 bp、15,403 bp和15,417 bp。三者均包含典型的37个基因（13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因）和一个富含A+T的区域。其基因排列顺序与大多数鳞翅目昆虫一致，在A+T丰富区和ND2基因之间存在典型的tRNA基因重排（trnM–trnI–trnQ）。
3.3 系统发育分析
基于14个物种（本研究测序的3个物种及公共数据库的11个物种）线粒体基因组序列进行的系统发育分析（贝叶斯推断和最大似然法）结果显示，Spodoptera属内的物种形成了一个单系群。YSAW和S. praefica在系统发育树上互为姐妹群，而SAW的系统发育位置在不同分析方法中存在不一致，反映了其与近缘物种关系的复杂性。
3.4 引物区域与位点的序列差异
通过比对分析，研究者在COI基因内为SAW筛选出一个425 bp的特异性区域（位于DNA条形码标准区域内），为YSAW筛选出一个547 bp的3‘-末端特异性区域。序列差异分析表明，这两个目标物种的引物设计区域与其近缘的非目标物种之间存在显著的序列差异，这为设计高特异性LAMP引物奠定了基础，最大限度地减少了假阳性扩增的可能性。
3.5 环引物的敏感性测试
在建立LAMP反应体系时，研究发现对于SAW的诊断，使用全部六个引物（四个核心引物F3、B3、FIP、BIP以及两个环引物LF、LB）会导致在部分非目标物种（S. depravata, S. litura, S. praefica）中出现非特异性扩增。通过逐一排除测试，最终确定使用包含四个核心引物和LB引物的五引物组合可以实现SAW的特异性检测。而对于YSAW的诊断，全部六个引物组合即可实现高特异性。
3.6 有效性验证
使用包含13个非目标物种（包括5种其他Spodoptera物种、7种其他鳞翅目害虫，以及目标物种互为非目标对照）的DNA样本对优化后的SAW和YSAW LAMP引物组进行验证。结果显示，两种检测方法均表现出高度的物种特异性，仅在对应的目标物种DNA中观察到明显的阳性反应（凝胶电泳呈阶梯状条带，加入SYBR Green染料后颜色由橙变绿并在紫外光下产生荧光），所有非目标物种及阴性对照均为阴性。
3.7 反应条件优化
通过对反应温度（60°C–67°C）和时间（10–40分钟）的梯度测试，确定了两种LAMP检测的最佳反应条件。SAW检测的最高有效反应温度为66°C，YSAW为63°C，两者均可在25分钟内完成稳定可靠的检测。
3.8 附加特异性测试
为了进一步验证检测方法的广泛适用性，研究额外使用了12种来自6个不同科的其他鳞翅目害虫的DNA样本进行测试。结果显示，这两种LAMP方法对新增的非目标物种同样具有良好的特异性，进一步证实了其作为诊断工具的可靠性。
3.9 粗提DNA的敏感性测试
为评估该方法在田间应用的便捷性，研究使用从成虫后足通过快速裂解法（15分钟内完成）制备的粗提DNA进行LAMP检测。结果显示，针对SAW和YSAW的LAMP检测均能成功地从粗提DNA样本中特异性扩增出目标片段，表明该方法完全适用于对样本DNA纯度要求不高的田间快速诊断场景。
在结论与讨论部分，研究强调了在气候变化和国际贸易背景下，快速诊断对于防止SAW和YSAW等入侵性害虫定殖的极端重要性。本研究成功开发了基于线粒体COI基因的LAMP检测方法，与之前基于全基因组序列开发的方法相比，线粒体DNA（mtDNA）途径具有数据获取相对容易、成本较低的优势，显示出良好的可扩展性。所设计的LAMP引物经过严格测试，能准确区分目标物种与其近缘种及其他常见鳞翅目害虫。特别重要的是，该方法成功应用于粗提DNA，且反应时间短（25分钟），这使其成为理想的田间即时检测（Point-of-care testing, POCT）工具。该研究为植物检疫部门和农业植保人员提供了强有力的技术武器，能够实现对这些高风险检疫性害虫的早期、快速、准确监测，从而为采取及时的防控措施、防止其入侵和扩散赢得宝贵时间，对保障农业生产和生物安全具有重要的现实意义和应用价值。
