一种新型的酶联免疫吸附测定（CELISA）方法，该方法使用高性能单克隆抗体来检测猪轮状病毒血清学指标

《Journal of Virological Methods》：A novel cELISA using a high-performance monoclonal antibody for serological detection of porcine rotavirus

猪圆环病毒（PoRV）VP4蛋白靶向的竞争ELISA（cELISA）开发及验证。基于高亲和力单抗mAb16，建立灵敏度高（AUC=0.995）、特异性强（98.28%）的cELISA，可准确检测PoRV中和抗体水平，支持多基因型（G4P[23]、G5P[23]、G9P[7]）诊断，并实现高通量检测。mAb16结合位点位于VP5域，验证了跨基因型的检测能力及无交叉反应特性，为疫苗评估和流行病学监测提供新工具。

　　

Jiapeng Song|Jiali Zhao|Xianyu Bian|Xuechao Tang|Chen Wang|Wei Wang|Jinzhu Zhou|Junming Zhou|Ran Tao|Li Mao|Xuejiao Zhu|Rui Luo|Bin Li|Xuehan Zhang

江苏省农业科学院兽医研究所；农业农村部兽医生物工程与技术重点实验室；江苏省食品质量安全重点实验室（国家重点实验室培育基地），中国南京210014

摘要

猪轮状病毒（PoRV）是导致仔猪严重腹泻的主要原因，这凸显了开发高效血清学工具以支持监测和疫苗评估的必要性。虽然病毒中和试验（NTs）仍然是检测功能性抗体的金标准，但它们劳动强度大且通量低。为了解决这一限制，我们基于一种高亲和力单克隆抗体（mAb16）开发了一种竞争性酶联免疫吸附测定法（cELISA），该抗体针对PoRV的VP4刺突蛋白。当在先前通过NT鉴定的猪血清样本组中进行验证时，cELISA表现出优异的诊断性能，接收者操作特征曲线下面积（AUC）为0.995，敏感性为96.00%，特异性为98.28%。值得注意的是，cELISA的抑制百分比值与中和抗体滴度之间存在强烈的正相关（Pearson r = 0.846）。在包括G4P[23]、G5P[23]和G9P[7]在内的多种PoRV基因型中，这种相关性在对照疫苗试验中得到了进一步确认。该测定法还具有高分析灵敏度，不与其他常见猪病原体发生交叉反应，并且具有出色的检测内和检测间重复性。表位定位将mAb16的结合位点定位于VP4的VP5亚基上，为其广泛的基因型交叉反应提供了结构基础。总体而言，这种cELISA为PoRV血清监测和疫苗免疫原性评估提供了一种灵敏、特异且高通量的替代方法。

引言

轮状病毒（RV）是全球婴幼儿和新生牲畜严重脱水性腹泻的主要原因，给全球公共卫生带来了巨大负担（Díaz Alarcón等人，2022年）。猪轮状病毒（PoRV）是导致仔猪病毒性胃肠炎的主要病原体，引起广泛的新生儿和断奶后腹泻，给养猪业带来了显著的经济损失，尤其是在中国（Zhang等人，2024年）。作为呼肠孤病毒科（Reoviridae）的成员，轮状病毒具有分段的双链RNA基因组。其遗传多样性主要由外衣壳蛋白VP7（决定G基因型）和VP4（决定P基因型）决定（Long和McDonald，2017年）。VP4蛋白在病毒附着和进入过程中起关键作用。它被切割成VP8和VP5结构域，是中和抗体的主要靶标（Luo等人，2024年；Tang等人，2024年；Witte等人，2022年）。 血清学监测对于了解PoRV的流行病学、评估疫苗效力以及制定控制策略至关重要。目前，有多种免疫测定方法（包括间接ELISA、病毒中和试验（VN）和免疫荧光测定）用于检测RV特异性抗体（Achá Alarcón等人，2022年；Kumar等人，2022年）。然而，这些方法通常受到通量低、解释主观性或需要培养活病毒的限制，这限制了它们在大规模现场研究中的应用。特别是使用多克隆抗体的间接ELISA可能由于非目标抗体的结合而缺乏特异性，而VN测定尽管是金标准，但劳动强度大、耗时且需要生物安全防护。因此，迫切需要一种快速、可靠且高通量的血清学测定方法，能够准确检测不同P基因型的PoRV特异性抗体。 竞争性ELISA（cELISA）是一种利用标记单克隆抗体（mAb）的强大方法。这种mAb与固定抗原的结合被血清样本中存在的抗体特异性抑制，从而实现高度特异性的检测，并且不依赖于抗体的类型（Guo等人，2023年；Yu等人，2025年）。cELISA的性能关键取决于mAb的质量，理想情况下，mAb应具有高亲和力、广泛的反应性和最小的交叉反应性。迄今为止，只有少数针对PoRV VP4的mAb被表征，且没有一个被开发成用于常规血清诊断的验证过的cELISA平台。 在这项研究中，我们开发并表征了一种新的鼠源单克隆抗体mAb16，该抗体针对PoRV的VP4蛋白。在初步测定中，mAb16表现出异常高的亲和力（KD = 1.25 nM）、广泛的基因型反应性和强大的阻断活性。利用这种mAb，我们建立并验证了一种基于辣根过氧化物酶（HRP）标记的mAb16的cELISA，用于检测猪血清中的PoRV抗体。该测定法经过了严格优化，其分析灵敏度、特异性、重复性和临床性能（包括对接种疫苗猪的抗体动态的纵向监测）得到了全面评估。表位定位将mAb16的识别位点定位于VP5结构域，为其功能特性提供了机制基础。由此产生的cELISA是一种稳健的高通量工具，在PoRV血清监测、疫苗评估和流行病学研究中具有巨大潜力。

细胞和病毒

MA104细胞和HEK-293T细胞购自中国上海的国家认证细胞库，并在添加了10%热灭活胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。所有细胞均在37℃、5% CO₂湿润的培养箱中培养。

PoRV NJ2012（G9P[7]；登录号：MT874983-MT874993）、PoRV JSNJ2019（G1P[7]；登录号：PP100160.1-PP100170.1）、PoRV AHFY2022（G9P[23]；登录号：OQ979280-OQ979290）、PoRV JSJR2023（G4P[23]；

mAb16的表征

为了建立一种针对VP4的cELISA，我们使用重组VP4*作为包被抗原，筛选了内部mAb库（补充图S1A）。三种mAb——标记为mAb16（补充图S1B-D）、mAb23和mAb24——通过NT测定证实了对PoRV阳性血清具有显著的竞争性抑制作用（补充表S1）。其中，mAb16表现出最高的阻断效果，在多个阳性血清样本中抑制了超过60%的结合

讨论

猪轮状病毒是影响新生和断奶仔猪的主要肠道病原体，导致高感染率、长期腹泻和体重增长减缓。这些效应由于饲料效率降低和生产成本增加而造成显著的经济损失（Paw?uszkiewicz等人，2025年；Song等人，2024年；Wu等人，2024年）。在猪群中，如P[7]、P[13]和P[23]等基因型的高流行率（Geng等人，2025年），包括在接种疫苗的群体中，进一步强调了

结论

总之，我们开发了一种新型的高性能cELISA，用于PoRV的血清学监测，该测定法利用了一种特异性表征的mAb，该mAb针对VP5结构域内的保守表位。与现有方法相比，该测定法具有明显优势——特别是其与功能性中和免疫的强相关性以及广泛的基因型反应性——使其成为兽医诊断、疫苗评估和流行病学监测的宝贵新工具。

CRediT作者贡献声明

Xuejiao Zhu：软件开发。Li Mao：方法学研究。Xuehan Zhang：写作——审阅与编辑、撰写初稿、项目管理、方法学研究。Jiapeng Song：写作——审阅与编辑、撰写初稿、验证、资源管理、数据分析、数据整理。Rui Luo：方法学研究。Xianyu Bian：方法学研究、实验设计、数据分析。Bin Li：写作——审阅与编辑、数据可视化、验证、概念化。Jiali Zhao：软件开发、资源管理、方法学研究。Chen Wang：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2023YFD1800502）、江苏省农业科技创新基金（CX(23)1029）、国家自然科学基金（32573401, 32302892）、江苏省自然科学基金（BE2023317）以及江苏省农业科学院大型科学仪器开放共享独立研究项目（GX(23)2001）的支持。