通过Red/ET重组技术构建和修饰基于低拷贝质粒的GI-19基因型IBV感染性克隆：一种简化且高效的冠状病毒反向遗传学系统

《Poultry Science》：Construction and Modification of a Low-Copy Plasmid-Based Infectious Clone for GI-19 genotype IBV via Red/ET Recombineering: A Simplified and Efficient Reverse Genetics System for Coronavirus

　　

冯克宇|李雅娟|宋超毅|邵冠明|王海龙|傅俊|谢青梅

摘要

禽传染性支气管炎病毒（IBV）属于伽马冠状病毒（γ-CoV）家族，是影响全球家禽产业的最重要的病原体之一。在本研究中，我们建立了一种针对GI-19基因型IBV的的新型逆向遗传学克隆平台。该平台结合了低拷贝质粒载体与Red/ET重组技术，并采用了正选择和反选择策略，实现了基因组cDNA组装、精确基因修饰以及重组病毒快速筛选的高效流程。具体而言，我们开发了一种利用p15A-CmR低拷贝质粒载体通过RecE/RecT介导重组来组装多个病毒片段的一步法。应用该系统，成功构建并拯救了GI-19基因型IBV的传染性克隆p15A-CmR-D90。这一策略显著提高了克隆稳定性及操作灵活性，实现了全长IBV基因组cDNA的无缝组装。此外，我们还建立了一种基于两步Redα/Redβ介导重组及正反选择的高效靶向基因修饰方法，能够精确地对IBV基因组进行突变、插入、删除或替换等操作，从而实现对病毒基因组的精细调控。该平台的可靠性通过成功生成并拯救重组病毒rD90-?5a/EGFP得到了验证：在该病毒中，D90菌株中的非必需基因5a被增强型绿色荧光蛋白（EGFP）所取代。总体而言，本研究建立的方法和策略为IBV及冠状病毒的逆向遗传学研究及重组疫苗开发提供了通用的、可扩展的技术基础。