在体外肠道上皮模型中，对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的毒力和炎症潜能进行多组学表征

《Science of The Total Environment》：Multi-omics characterisation of the virulence and inflammatory potential of Bacillus thuringiensis in an in vitro intestinal epithelial model

苏云金芽孢杆菌（Bt）作为生物农药的应用安全性研究中，利用人类肠道Caco-2细胞模型分析其毒理机制。研究发现Bt菌株 supernatants未显示细胞毒性，但显著诱导IL-8炎症因子释放，提示慢性炎症风险。组学分析揭示氧化磷酸化和脂代谢通路异常，且Bt supernatants导致肠道细胞膜CD59/CD55复合物释放，表明可能增强自身免疫攻击。需针对不同Bt亚种（如aizawai、kurstaki、israelensis）进行个体风险评估。

　　

Sarah Alilat | Rachelle Lanceleur | Mathilde Bonis | Sylvie Pairaud | Natália Pinto De Almeida | Ga?lle Vial | Xavier Sarda | Olivier Firmesse | Valérie Fessard | Sophie Liuu | Thibaut Léger

法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）Fougères实验室污染物毒理学部门，法国福热尔，邮编35306

摘要

土壤细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）能够产生含有杀虫活性的孢子和晶体。基于这些特性，一些Bt菌株被开发为生物农药，用于害虫控制，为化学杀虫剂提供了替代方案。然而，Bt菌株属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，简称Bc）属，并且共享一些编码腹泻性肠毒素的毒力基因，如溶血素BL（Hbl）、非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒素K（Cyt-K2）。已知这些毒素与由Bc引起的食源性疾病（Foodborne Outbreaks，简称FBOs）有关。因此，有人认为Bt也可能导致FBOs，因此评估其毒力潜力及其对人类健康的影响至关重要。为此，我们使用经过分化的Caco-2人肠细胞（模拟肠道屏障）处理了五种用作生物农药的Bt菌株的上清液。与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cytotoxicus，简称Bcyt）的上清液相比，任何Bt上清液在处理24小时后均未观察到细胞毒性。然而，Bt和Bcyt的上清液均显著增加了白细胞介素8（IL-8）的分泌，表明可能存在慢性炎症的风险。为了研究Bt上清液对Caco-2细胞的分子效应，我们使用两种非细胞毒性浓度对细胞培养基和裂解物进行了非靶向蛋白质组学和代谢组学分析。这两种方法均显示，暴露于Bt或Bcyt上清液后，氧化磷酸化和脂质代谢发生了共同紊乱。只有Bcyt暴露时，与急性炎症相关的蛋白质表达减少。Bt上清液导致CD59和CD55这两种膜结合的补体抑制因子释放到培养基中，这表明Bt上清液可能增加肠道细胞对其自身免疫系统的敏感性。蛋白质组学分析还揭示了不同Bt亚种上清液中毒素含量的差异，这强调了在评估其作为生物农药的风险时需要单独评估每个菌株的必要性。

引言

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）广义上包括多种革兰氏阳性细菌（Carroll等人，2022年），它们存在于各种环境中，如土壤、水、植物、食物（McDowell等人，2023年），甚至人类和动物的肠道中（Stenfors Arnesen等人，2008年）。这些微生物既能在富氧条件下也能在缺氧条件下生存和生长，属于兼性厌氧菌（Ehling-Schulz等人，2019年）。这种适应性使它们能够定植于多种栖息地并适应不同的环境条件（Ehling-Schulz等人，2019年）。迄今为止，已有近30种细菌被归类为Bc属，其中最著名的包括炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）、蜡样芽孢杆菌狭义（B. cereus sensu stricto）、蜡样芽孢杆菌毒性株（B. cytotoxicus）和苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）。已知某些Bc属成员对人体具有致病潜力，尤其是通过引发食源性疾病（FBOs）（Dietrich等人，2021年）。此外，Bc属是法国FBOs的首要原因（SPF，2024年），也是欧洲因细菌毒素导致的FBOs的首要原因（EFSA等人，2024年）。Bc属细菌由于产生毒素，可导致感染者出现腹泻和/或呕吐症状（Ehling-Schulz等人，2004年；Schoeni和Wong，2005年）。呕吐症状表现为恶心、呕吐和不适，这是由于摄入了食物中的蜡样毒素（cereulides）和/或异蜡样毒素（isocereulides）（Ehling-Schulz等人，2015年）。而腹泻症状则是由宿主肠道内产生的肠毒素引起的（Stenfors Arnesen等人，2008年）。除了这些症状外，这些病原体还可能引发其他多种疾病，包括内眼炎、菌血症、败血症、心内膜炎、肺炎、脑膜炎和皮肤感染（Bottone，2010年；Drobniewski，1993年；Senesi和Ghelardi，2010年）。目前，除了婴儿配方奶粉外，欧洲尚无针对Bc属的特定食品安全标准（Bonis等人，2021年；编辑们，2023年）。不过，法国已制定了一个警戒阈值，即每克食品中菌落形成单位（CFU）不超过10^5个（Agriculture FM，2009年；SPF，2021年）。根据欧洲食品安全局（EFSA，2016年）的说法，需要进一步研究Bc属细菌对人类健康的潜在风险，特别是苏云金芽孢杆菌（Bt）（EFSA，2016年）。

Bt是一种属于Bc属的土壤细菌。在该属中，它是唯一一种在孢子形成阶段能够产生具有杀虫特性的结晶蛋白质包含体的成员（Palma等人，2014年）。这些蛋白质包含体由δ-内毒素（Cry/Cyt家族）组成，对不同昆虫的幼虫具有不同程度的毒性，例如鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）和甲虫目（Coleoptera），或这些目的组合（Koni和Ellar，1994年）。一旦被摄入，原毒素可在中肠蛋白酶的作用下激活（Koni和Ellar，1994年），然后与幼虫肠上皮细胞的特定受体相互作用，导致细胞膜形成孔洞、细胞裂解和昆虫死亡（Bravo等人，2007年）。由于这些昆虫病原特性，自20世纪30年代以来，Bt就被用作生物农药来对抗昆虫害虫，并且越来越多地被用来替代化学农药（Agboola等人，2022年）。值得注意的是，市面上90%的微生物生物农药可能来源于这种细菌（Kumar等人，2021年）。

作为Bc属的一员，Bt拥有毒力基因，包括编码肠毒素的基因，这些肠毒素在FBOs期间可导致腹泻症状（Gaviria Rivera等人，2000年）。这些肠毒素包括溶血素BL（Hbl），由三个蛋白质亚单位组成（Hbl L1、Hbl L2、Hbl B）（Beecher和Macmillan，1991年）、非溶血性肠毒素（Nhe），由三个蛋白质亚单位组成（NheA、NheB、NheC）（Lund等人，2000年）以及细胞毒素K（CytK）。这些肠毒素具有坏死和溶血作用，同时对人类肠上皮细胞也有毒性（Cairo等人，2022年；Zeighami等人，2020年）。Hbl、Nhe和CytK通过形成孔洞在破坏细胞膜方面起着关键作用（Cairo等人，2022年；Fagerlund等人，2010年）。Hbl和Nhe毒素通过多步骤过程起作用，最初在溶液中形成复合物（Tausch等人，2017年），然后附着在细胞膜上（Jessberger等人，2020年）。这一步骤会导致形成所谓的“前孔洞”，随后发展成功能性孔洞（Dietrich等人，2021年）。关于CytK毒素，其作用机制在孔洞形成方面与之前的毒素不同。CytK毒素最初是溶液中的可溶性单体，可以结合目标膜形成七聚体结构，然后发生构象变化以在细胞膜上形成功能性孔洞（Dietrich等人，2021年）。

卫生当局（EFSA和法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES））指出，目前缺乏了解用作生物农药的不同Bt菌株有害效应所需的数据。这些菌株包括来自aizawai亚种的GC-91和ABTS-1857菌株、来自kurstaki亚种的EG2348和SA-11菌株，以及来自israelensis亚种的AM65–52菌株（EFSA等人，2018年）。数据缺口主要是由于检测和区分Bt与Bc属物种的方法存在局限性，这些方法在常规程序中并不常用（EFSA等人，2021年）。多项研究表明，Bt可能导致FBOs的发生。例如，最近的一项研究发现，2022年法国报告的FBOs中有28%与Bc有关（SPF，2024年），另一项研究调查了39起涉及Bc属的食品中毒事件（Johler等人，2018年），结果显示其中18%的病例中存在Bt（McIntyre等人，2008年）。更近期的一项研究回顾性地发现，Bt与250起Bc相关FBOs中的20%有关（Bonis等人，2021年；编辑们，2023年）。与FBOs相关的分离株与某些商业Bt分离株之间的显著相似性表明，Bt生物农药可能具有致病潜力（Bonis等人，2021年）。

肠上皮细胞作为保护屏障起着至关重要的作用，限制了对内部器官的潜在损害（Lopez-Escalera和Wellejus，2022年）。为了了解Bt生物农药对这一屏障的毒性效应，我们使用了经过分化的Caco-2细胞，这些细胞能有效模拟消化上皮细胞（Verhoeckx等人，2015年）。我们使用五种Bt菌株（分别属于aizawai、kurstaki和israelensis亚种）研究了Bt的毒性机制，并将其与Bc属中高毒力的成员蜡样芽孢杆菌毒性株（Bcyt）引起的毒性进行了比较（作为阳性细胞毒性对照）。特别是，对未分化的Caco-2细胞的毒性进行了全面分析，以评估Bt菌株与其他Bc属成员的毒性（Fichant等人，2024年）。这项包含48种Bacillus亚种的数据集研究表明，某些Bc属菌株，包括几种Bt生物农药，可能导致Caco-2细胞发生细胞毒性。这种细胞毒性与促炎细胞因子的释放有关。据我们所知，这是首次使用人类肠细胞模型测试所有在欧洲注册的农药菌株，并将其与多种Bacillus亚种进行比较。我们的分析重点关注使用分化的Caco-2细胞暴露于Bt亚种和Bcyt菌株上清液后，细胞活力、促炎效应及潜在的分子机制。我们利用高分辨率质谱技术研究了肠细胞和细胞培养基的蛋白质组和代谢组变化。此外，我们还进行了蛋白质组学分析，以更好地了解Bt亚种的毒力潜力，并将毒素含量与宿主体内的信号通路联系起来。

部分摘录

细菌上清液

五种苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株和一种蜡样芽孢杆菌毒性株（Bacillus cytotoxicus）菌株（表1）在tryptone soya yeast extract agar（TSYEA）培养基（Biomérieux）上于30°C培养18–24小时。扩增后，将分离出的菌落预培养18小时，温度同样为30°C，培养液为10 mL脑心浸出液（BHI，Biomérieux）。随后，向10 mL BHI培养基中加入初始光密度OD_600nm = 0.05的菌液，并在37°C、300 rpm的条件下培养5小时，最终光密度达到1.5至2。

确定Bt上清液对肠细胞作用机制的策略

为了研究基于Bt的生物农药在食品安全方面的毒力潜力及其对人类肠道的影响，我们对暴露于Bt和Bcyt上清液的分化Caco-2细胞进行了多组学研究。本研究中获得的数据集的生成流程如图1所示。通过活力测定和ELISA检测分别评估了Bt上清液对Caco-2细胞的细胞毒性效应及其促炎效应。

讨论

在这项研究中，我们采用多组学方法研究了不同Bt菌株对人类肠细胞的毒力和细胞毒性机制。在浓度高达25%的情况下，没有任何Bt上清液改变分化Caco-2细胞的活力。然而，由于aizawai亚种和kurstaki亚种的Bt会改变未分化Caco-2细胞的活力（Fichant等人，2024年），我们的结果表明，复制中的细胞对Bt毒素的敏感性更高。

CRediT作者贡献声明

Sarah Alilat：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，项目管理，方法学，研究，数据分析，数据管理。 Rachelle Lanceleur：方法学，研究，数据分析。 Mathilde Bonis：方法学，概念化。 Sylvie Pairaud：方法学，研究，数据管理。 Natália Pinto De Almeida：撰写 – 审稿与编辑。 Ga?lle Vial：概念化。 Xavier Sarda：

利益冲突声明

我们没有需要声明的利益冲突。

致谢

作者衷心感谢Anne-Louise Blier、Pierre-Jean Ferron和Kevin Hogeveen（法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）Fougères实验室污染物毒理学部门）的技术支持。同时感谢Carolyn Engel-Gautier（Coup de Puce Expansion）对本文英文版本的校对。本研究得益于国家-地区计划合同（CPER ICE 2021–2027）资助的设备，该合同由欧洲共同资助。