综述：微流控技术创新正在推动精子运动能力和性别分离技术的发展

《Biomaterials Advances》：Microfluidic innovations driving the future of sperm motility and sex sorting techniques

精子分选技术综述：传统方法存在机械应力大、效率低、精子活性受损等问题，而微流控技术通过模拟生理微环境（如 chemotaxis/thermotaxis/rheotaxis）实现精准分选，提升精子活性（DFI<5%）和分选效率（>90%活力回收），并推动性分选技术发展，但面临成本高、规模化难等挑战。

　　

维迪·达斯（Vidhi Das）| 阿比纳亚·拉詹德兰（Abinaya Rajendran）| 拉克希米·克里希南（Lakshmi Krishnan）| 范刚·曾（Fan-Gang Tseng）| 图欣·苏布拉·桑特拉（Tuhin Subhra Santra）

印度理工学院马德拉斯分校工程设计系，金奈，印度

摘要

精子分选在辅助生殖技术（ART）中起着关键作用，确保选择功能健全的精子，从而提高受精、着床和妊娠的成功率。尽管传统方法（如上游法、密度梯度离心和简单洗涤技术）被广泛使用，但它们常常受到机械应力、效率降低和精子完整性受损的限制。基于性别、表面电荷或免疫学策略的精子分选方法也面临挑战，包括成本高昂、DNA损伤以及临床应用有限的问题。微流控技术的最新进展为ART带来了变革，提供了仿生微环境，能够复制精子的趋化性、趋热性和趋流性运动机制，同时实现基于运动能力的精确分选，且操作简便。微流控平台不仅提高了形态优良、基因完整的精子的分离效率，还为传统方法提供了可扩展、快速且侵入性较小的替代方案。本文回顾了精子性别和运动能力分选技术的发展历程，重点介绍了微流控平台的最新进展，并探讨了其在畜牧业繁殖中的应用前景。微流控设备设计的创新，包括微通道几何结构、集成流式细胞术、光子分离和介电泳技术，展示了其在性别分选方面的巨大潜力。最后，我们讨论了未来的发展方向，包括自动化、生物传感和人工智能的整合，这些技术有望为生殖医学和生物技术领域中的精准精子选择建立新一代平台。

引言

不孕症是12-18%夫妇面临的日益普遍的健康问题，全球约有5000万至8000万人受到影响，这迫切需要及时、低成本且易于获得的诊断和治疗方案[1]。辅助生殖技术（ART），如宫腔内人工授精（IUI）、体外受精（IVF）和单精子注射（ICSI），已经改变了受影响夫妇的生育前景，并越来越多地应用于畜牧业和动物科学的控制繁殖。

ART的准备工作主要依赖于传统的精子处理方法，包括上游法、磁激活细胞分选（MACS）、简单洗涤和密度梯度离心（DGC）。虽然这些方法被普遍采用，但它们涉及高速离心、突然重悬和机械操作，所有这些都会使精子受到剪切力和氧化应力的影响，产生活性氧（ROS），导致DNA片段化并降低精子活力[2]。关键的是，这些体外协议与体内自然的选择机制不同，几乎总是需要在ICSI或IVF等程序之前由胚胎学家进行视觉评估，这引入了主观性和额外的操作风险。

在过去三十年中，由于微纳技术的快速发展，结合化学、化学工程、机械工程、生物工程和生物医学工程，微流控技术或芯片实验室（LOC）或微总分析系统（μTAS）已成为在微流控环境中操纵复杂化学和生物物质的强大工具，且样品消耗量极少[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。

微流控技术作为辅助生殖技术（ART）的颠覆性平台，相比传统的精液处理方法，提供了无与伦比的准确性、仿生调节能力和温和的物理应力。微流控或芯片实验室技术利用层流、流体动力学控制的流动以及与女性生殖系统高度相似的微结构，在接近生理条件下实现高质量精子的无标记分离[8]、[9]。微流控设备利用精子的行为机制，如趋流性（逆流运动）、趋热性（沿温度梯度运动）和趋化性（朝向化学信号运动），主动或被动地将运动能力强、形态正常的精子引导至收集区[10]、[11]。被动微流控配置，如柱状阵列、微通道分叉和径向网络结构（例如SPARTAN——简单的周期性阵列用于捕获和分离），能够在10分钟内实现高达90%的运动能力精子的分离，DNA片段化指数（DFI）降至5%以下，其速度和质量均优于上游法[8]、[9]。结合热梯度或声学驱动的主动系统进一步增强了精子活力的恢复，一些超声耦合的微滴装置通过激活线粒体功能，使精子活力提高了200%以上[12]。惯性微流控技术利用弯曲通道和迪恩流（Dean flow）根据细胞大小和形状进行聚焦，甚至可以分离非运动但健康的精子，适用于严重少精子或弱精子的样本[13]。临床证据支持这些创新：在一项95例ICSI随机试验中，微流控精子分选（MSS）显著提高了运动能力、精子形态，并降低了DFI，从而提高了优质胚胎的产生率、着床率和临床妊娠率[14]。临床可用的系统，如ZyMōt?（由DxNow Inc.开发）和Fertile Plus，利用微通道或多孔膜从原始精液中分离运动精子，减少了操作步骤，并在反复ART失败的情况下显示出更好的受精效果，尽管有报道称由于样本量小，差异不显著[10]、[15]。除了运动能力选择外，微流控技术还在推动精子性别分选方面的创新。这种方法在动物繁殖中已被证明有效，也可能在人类ART中用于预防性别相关疾病。传统的基于流式细胞术的性别分选（例如MicroSort?）由于X染色体和Y染色体精子之间的DNA含量差异可以实现高纯度分离，但它需要荧光染色，受到高细胞剪切力的影响，且成本较高，从而限制了其在人类ART中的应用[16]。微流控性别分选试图通过无标记、低剪切的方法（如介电泳（DEP）绕过这些限制，在非均匀电场中产生X染色体和Y染色体精子的独特轨迹[17]，以及光子微流控技术，通过脉冲激光光引导X或Y染色体精子而无需染色。早期版本的性别分选准确率可达70%，存活率损失可忽略不计，尽管通量和纯度仍低于亚流式细胞术标准（新西兰Engender Technologies，2023年）。尽管在大多数法律体系中，人类性别分选在伦理上仍有限制，但它已在动物繁殖、保护生物学和配子生物学研究中得到广泛应用[18]。然而，微流控精子分选在主流临床应用方面仍面临一些挑战。设备的制造通常涉及高精度步骤和洁净室设备，这提高了成本并限制了大规模生产。操作问题，如通道堵塞、样品粘度变化，会危及可靠性；虽然回收的精子质量通常更好，但低于密度梯度离心（DGC）的效果，对于严重退化的样本来说尤其具有挑战性[8]、[9]。新兴的解决方案包括模块化微流控或芯片实验室平台，将精子分选与下游精液分析、胚胎培养甚至基因筛查集成在一个封闭的自动化系统中，利用数字微流控和AI辅助的选择算法[19]。从长远来看，微流控技术可能与体外配子发生（IVG）相结合，实现实验室衍生配子的选择和个性化ART工作流程，并具备芯片上的质量控制。伦理问题，特别是人类性别选择，将继续是核心；需要强有力的监管机制来协调技术潜力与社会责任[18]。图1总结了现有的基于微流控芯片的技术，这些技术能够按性别和运动能力对精子亚群进行分选。

本文全面概述了传统的和微流控的精子性别和运动能力分选方法，深入探讨了分选的有效性，并详细讨论了将微流控平台用于有效精子选择的集成方法。此外，本文强调了现有限制、实际挑战以及微流控技术在精准精子分选中的潜在进展和未来作用。

要理解精子分选以及按性别和运动能力有效选择精子，必须了解精子生物学、形态学、运动能力、精子引导机制和精子运动学。下面我们将重点介绍精子细胞生物学、形态学、运动学及其运动能力。

部分摘录

精子细胞生物学和形态学

为了设计出不仅高效而且优于现有传统技术的分选平台，必须对精子细胞生物学有基本的了解。微流控系统架构必须基于精子的物理尺寸、结构特征和运动机制。不同物种的精子基本解剖结构相似，仅存在大小、DNA含量和形状的微小差异。精子细胞由一个长约4-5微米的细长头部组成

基于运动能力的精子分选

基于运动能力的分选技术旨在从精液样本中选择最高质量、最具运动能力的精子。除了选择运动能力强的精子外，还需要去除不需要的细胞成分，如圆形细胞、上皮细胞、白细胞、未成熟的精子以及形态异常或不动的精子。尽管微流控设备具有许多优势，如模拟生理条件、实时观察和分析，但目前仍存在一些限制

基于性别的精子分选技术的发展

由于在畜牧业生产、保护生物学和临床医学中的重要意义，精子的性别选择长期以来一直受到科学和商业界的关注。在动物农业中，能够预先确定后代的性别具有显著的经济优势，特别是在奶牛和肉牛产业中，通常更倾向于选择雌性后代进行产奶，而在肉牛生产系统中则可能更倾向于选择雄性后代。在野生动物保护中，精子的性别

未来方向和新兴趋势

当前精子分选技术的进步反映了基于运动能力的分选（相对成熟）与基于性别的分选（在技术和临床应用方面仍具有挑战性）之间的明显差异。商业化的微流控运动能力平台，如ZyMōt?和Fertile Plus，以及传统的准备方法，表明运动能力分选已经成熟，并且越来越适合常规实验室工作流程。这些商业系统利用微通道或

结论

微流控技术的进步正在改变精子选择和性别分选的作用，提高了ART的准确性、效率和安全性。这为改善畜牧业繁殖提供了希望，特别是在公牛性别分选方面，选择性富集携带X染色体或Y染色体的精子可能会彻底改变奶牛和肉牛的生产方式。与传统的基于流式细胞术的性别分选相比，后者成本高昂、技术复杂，且常常导致精子质量下降

重要性声明

精子分选是辅助生殖技术的核心，然而传统方法（如上游法和密度梯度离心）常常会对精子造成机械应力并损害其完整性。新兴的微流控系统提供了仿生环境，利用趋化性、趋热性和趋流性引导，以最小的操作实现高运动能力、形态完整和基因稳定的精子分离。这些平台克服了长期存在的限制

CRediT作者贡献声明

维迪·达斯（Vidhi Das）：撰写——原始草稿，数据整理。阿比纳亚·拉詹德兰（Abinaya Rajendran）：撰写——原始草稿。拉克希米·克里希南（Lakshmi Krishnan）：撰写——原始草稿。范刚·曾（Fan-Gang Tseng）：验证。图欣·苏布拉·桑特拉（Tuhin Subhra Santra）：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们衷心感谢印度-台湾科技合作项目、印度政府科学技术部（DST）和印度国家工程院（INAE）（授权号：2024/IN-TW/10）的财政支持，该资助授予了图欣·苏布拉·桑特拉博士。