《Bioresource Technology》：Unlocking catalytic capacity of (S)-selective ω-transaminases toward aryl methyl ketones via pocket engineering and droplet screening
编辑推荐：
ω-转氨酶（ω-TAs）工程策略通过口袋改造与高通量筛选提升催化效率，以TbTA为酶骨架，结合FADS技术筛选出W62L/I263G突变体，实现95%转化率与>99.9%ee值的chiral中间体生产，其中I263G突变具有跨酶类适用性。
桂萍|李晓|江旺涛|杨若琳|常佩瑶|聂兴旺|王新瑞|王学峰|江静洁|王丽艳|郭小杰|邹洪斌|马福强
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，中国苏州215163
摘要
ω-转氨酶（ω-TAs）在催化手性胺的非对称合成方面表现出显著的效率和立体选择性，使其成为生产药物手性中间体的理想生物催化剂。然而，开发一种通用策略来显著提高不同ω-TAs对大体积底物的接受能力仍然是一个主要挑战，因为大多数酶工程努力都是特定于案例的，并且缺乏高效的筛选方法。在这里，我们提出了一种高效的ω-TAs工程策略，通过将1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙烷-1-酮（1a）直接转化为抗癌药物普拉塞尔替尼的高价值手性中间体((S)-1b）来实现。基于一种嗜热酶支架，结合口袋工程和荧光激活液滴分选（FADS）技术，获得了W62L/I263G变体，该变体通过口袋扩展显著提高了对1a的活性。这种工程方法克服了野生型ω-TA的催化限制，在一小时内实现了95%的转化率和超过99.9%的对映体过量（ee）。值得注意的是，I263G突变使多种(S-选择性的ω-TAs能够接受一系列芳基甲基酮，将其催化效率从可忽略提高到高水平。我们这种广泛适用的策略，将口袋工程与高通量筛选相结合，为ω-TAs工程提供了新的范例，并为生物催化合成大体积手性胺提供了通用潜力。
引言
手性胺是制药和精细化工行业中广泛使用的关键中间体。由于社会和环境对化工行业绿色工艺的需求不断增加，酶催化策略在手性胺中间体的非对称合成中受到了广泛关注（Buller等人，2023年；Reetz等人，2024年）。ω-转氨酶（ω-TAs）因其出色的立体选择性、辅因子的自我再生以及理论上100%的产率而成为合成手性胺的最有前途的酶家族之一（Kelly等人，2018年；Sheludko等人，2022年）。代表性应用包括抗糖尿病药物西格列汀的合成（Savile等人，2010年）、瑞美格 pant 中间体（Ma等人，2022年）以及除草剂l-膦硫酰丙嗪（Liu等人，2024年；Yi等人，2025年）。此外，ω-TAs还广泛应用于重要非手性胺的绿色合成，如呋喃胺（Di等人，2023年；Tang等人，2023年）和香草胺（Di等人，2026年；Li等人，2025a；Zhang等人，2024年）。
ω-转氨酶利用吡哆醛5′-磷酸（PLP）作为辅因子，根据立体选择性通常分为两类：PLP折叠I型家族中的III类（S-选择性）和PLP折叠IV型家族中的IV类（R-选择性）（Cárdenas-Fernández等人，2022年）。ω-TAs的催化过程遵循一个“乒乓球”双双机制，涉及两个半反应。这一机制促进了氨基从供体向受体的转移，并伴随着辅因子PLP和吡哆胺5′-磷酸（PMP）的循环转化（Dourado等人，2016年；Kelly等人，2018年）。
尽管具有潜力，天然ω-TAs受到严格的底物选择性的限制（Gao等人，2025年）。它们的活性位点经过精细调节以识别天然底物，但对于生产高价值手性胺所需的大体积和非天然前体来说，立体容忍度不足（Cui等人，2024年）。因此，直接改造底物结合口袋仍然是提高对大体积底物催化活性的首选和最有效策略，这一点通过多项成功研究得到了证实（Menke等人，2024年；Wu等人，2025年；Xie等人，2025年）。通过十轮定向进化，Novick等人改造了一种高活性的ATA217变体，在底物结合口袋中引入了26个突变（Novick等人，2021年）。这种进化后的生物催化剂促进了心力衰竭主要治疗药物Sacubitril的大规模酶法合成。Yang等人重新设计了CC1012的底物结合口袋，降低了关键催化步骤的能量障碍（Yang等人，2022年）。所得到的最优变体对Ozanimod手性胺前体的催化活性提高了143倍。尽管越来越多的关于ω-TAs工程的研究使得各种高价值手性胺中间体的绿色合成成为可能，但这些突变往往缺乏可转移性（Meng等人，2022年）。酶的底物特异性与其活性位点的三维结构及催化过程中的复杂过渡态构型密切相关，这构成了一个主要挑战（Cui等人，2025年）。因此，开发大体积、非天然手性胺的绿色合成方法需要针对性地发现或设计定制的生物催化剂（Reetz等人，2024年）。
普拉塞尔替尼是一种高度选择性的RET（转染期间重排）激酶抑制剂，用于治疗无法切除或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）和髓样甲状腺癌（Shen等人，2022年；Syed，2022年）。手性中间体((S)-1b是普拉塞尔替尼合成的关键前体。然而，其生产目前受到高成本和传统化学途径的阻碍，该途径严重依赖手性辅助剂、过渡金属催化剂、有机溶剂和极端温度（方案1，氰色）（Brubaker等人，2022年）。相比之下，通过ω-TAs催化的生物合成途径提供了一种更高效的(S)-1b生产方法（方案1，粉色）。这一一步反应在温和条件下进行，具有显著优势，并满足了关键的工业需求。尽管理论上具有潜力，但前手性酮1a的酶法转化仍然具有挑战性。酮基附近存在一个大体积的吡啶-吡唑结构，对天然ω-TAs的有效底物适应性造成了显著的空间限制（Buller等人，2023年）。
此外，在酶工程中，突变库的筛选效率是一个关键的限速步骤，直接影响工程效率（Markel等人，2020年）。基于液滴的荧光激活液滴分选（FADS）是一种高通量筛选技术，广泛应用于酶工程和抗体工程等领域（Autour和Merten，2024年；Jiang等人，2023年；Song等人，2025年）。它具有出色的优势，包括超高的筛选通量（每天超过107个样本）、高灵敏度、操作简便性和低成本（Li等人，2025b）。这项技术为解决庞大库规模与有限筛选能力之间的不平衡提供了新的解决方案（Fu等人，2021年）。然而，由于缺乏合适的荧光耦合检测策略，它尚未成功应用于ω-TAs的定向进化。
在这里，我们使用嗜热TA作为支架，结合了口袋工程和专有的基于FADS的高通量筛选技术来鉴定优化的变体。结果，W62L/I263G变体同时表现出更好的热稳定性和活性，在1小时内实现了95%的普拉塞尔替尼手性中间体转化率和超过99.9%的对映体过量（ee）。从机制上讲，口袋改造适应了大体积底物，并优化了底物酮基相对于PMP的定位。更重要的是，I263G突变具有高度的可转移性，一致地提高了其他(S-选择性的ω-TAs对一系列芳基甲基酮的活性。这项工作为生物催化剂的高效分子工程提供了稳健的策略和理论基础。
化学试剂
吡哆醛5′-磷酸（PLP）、丙酮酸钠、2a乙酰苯酮、α-苯乙胺、3a4-氯乙酰苯酮和8a4-乙酰联苯从Sigma-Aldrich（美国）购买。1-庚酮(5a）、2-庚酮(6a)、7a2-乙酰芴、(S-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙胺((S)-1b)和(R-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙胺((R)-1b)从上海浩鸿科技有限公司（中国）购买。
选择合适的酶支架
来自嗜热微生物或通过酶工程获得的耐热酶通常被用作首选的生物催化剂（Han等人，2019年；Littlechild，2015年）。在手性胺合成中使用耐热ω-TAs的优势在于它们能够更好地适应工业需求，从而可能提高生产效率并降低工艺成本（Cárdenas-Fernández等人，2022年）。为了鉴定高质量的ω-TA作为酶支架，进行了两项研究
结论
本研究旨在开发一种通用策略，以提高ω-TAs对大体积底物的活性，从而为环保的手性胺的高价值非对称合成提供高效的生物催化剂。利用耐热TA作为支架和1a芳基甲基酮作为胺受体，我们通过半理性设计和基于FADS的高通量筛选成功获得了具有高活性和稳定性的稳健变体。
CRediT作者贡献声明
桂萍：撰写——原始草稿、可视化、资金获取、数据管理、概念化。李晓：形式分析、数据管理、概念化。江旺涛：可视化、方法学、数据管理。杨若琳：验证、数据管理。常佩瑶：验证、数据管理。聂兴旺：资金获取、形式分析。王新瑞：方法学。王学峰：监督。江静洁：监督。王丽艳：资源支持。郭小杰：资源支持。邹洪斌：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金 [32471321]、青年创新促进协会奖学金计划（CAS [2022327）、山东省自然科学基金（中国 [ZR2023QB240, ZR2023QC257）、浙江省自然科学基金（中国 [LZ21B020001）以及苏州基础研究试点项目[SSD2024010）的支持。
