《Biosensors and Bioelectronics》：Portable Amplification-Free Digital Droplet CRISPR/Cas12a Platform for One-Pot Multiplexed Viruses Detection with Attomolar Sensitivity
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便携式数字微滴CRISPR-Cas12a平台实现三重病原核酸同步检测，灵敏度达0.15 fM无需扩增，40分钟内完成检测，并开发算法驱动自动分析系统及微型设备。
季志润|赵一然|黄俊康|单彦凯|李家豪|黄庆华|吴明辉|刘飞
教育部动物健康与食品安全联合国际研究实验室，单分子生物化学与生物医学实验室（Sinmolab），南京农业大学兽医学院，南京210095，中国
摘要
高通量、灵敏且可现场部署的核酸检测对于及时监测病原体至关重要。在此，我们开发了一种新型的无扩增便携式平台，该平台基于无需仪器的多分散数字微滴CRISPR/Cas12a（DD-Cas12a）检测方法，能够在单次反应中同时检测三种合成核酸目标。该平台无需预扩增即可达到阿托摩尔级别的灵敏度（0.15 fM），在40分钟内生成检测结果，并且在存在10倍非目标核酸的情况下仍保持高特异性。DD-Cas12a进一步被用于检测一种DNA病毒（猪圆环病毒2型，PCV2）和两种RNA病毒（猪流行性腹泻病毒，PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。PCV2、PEDV和PRRSV的检测限分别为126.0、673.5和584.5 fg/μL，其灵敏度与qPCR相当，而PEDV和PRRSV的灵敏度则高出10倍。为了提高分析通量和客观性，我们建立了一种算法驱动的DD-Cas12a（ADC）平台，用于自动化图像分析和结果解码。我们开发了一种定制的微型便携式仪器，用于信号采集和现场部署。通过将DD-Cas12a检测方法与ADC平台和便携式仪器相结合，我们建立了一个便携式、数字化、无扩增且超灵敏的多病原体检测系统，为诊断、生物监测和环境监测提供了强大的工具。
引言
快速准确的病原体检测在疾病监测、临床诊断和疫情控制中起着重要作用（Feng等人，2020年；Liu等人，2020年）。在人类和动物健康以及食品安全和环境监测方面，及时识别病原体可以采取有效的干预措施，限制传播并减少经济损失（Ceresini等人，2024年；Meliana等人，2024年；Tong等人，2024年）。传统的核酸诊断方法主要依赖于定量聚合酶链反应（qPCR），但这种方法受到复杂热循环要求、较长检测时间和专业人员的限制（Blairon等人，2021年；Lima等人，2022年；Ma等人，2021年；Vogels等人，2020年）。等温扩增技术，如重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）和滚环扩增（RCA），已被广泛用于无需热循环的病原体检测（Gadkar等人，2018年；Jeong等人，2016年；Zhang等人，2024年）。虽然这些方法可以快速分析（通常在10-30分钟内得出结果），但其更广泛的临床应用常常受到分析灵敏度不足和交叉污染风险增加的制约（Saki等人，2021年；Srivastava和Prasad，2023年；Wang等人，2025年）。此外，基于这些等温扩增技术的多重检测通常需要严格的优化以避免交叉反应和信号干扰，严重限制了其实际应用。在全球养猪业中，共感染情况的高发迫切需要可靠的同时检测关键流行病原体。典型的目标包括RNA病毒猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），以及DNA病毒猪圆环病毒2型（PCV2）。现有的这些病原体的诊断策略主要依赖于多重qPCR（Feng等人，2024年；Wang等人，2024年；Ruan等人，2023年）和等温技术，如LAMP（Areekit等人，2022年；Hong等人，2023年；Zhou等人，2020年）和RPA（Sun等人，2025年；Ye等人，2024年；Xia等人，2022年）。然而，这些方法依赖于目标扩增，因此存在固有的定量偏差和交叉污染风险。因此，迫切需要开发一种先进的等温、无扩增且高度特异性的传感方法，以实现混合RNA和DNA目标的同时定量，以克服上述分析瓶颈。
在新兴的诊断技术中，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-Cas）系统已成为特定核酸检测的强大工具（Chen等人，2018年；Li等人，2018年；Lu等人，2022年）。目前，大多数CRISPR-Cas诊断（CRISPR-Dx）技术需要对目标核酸进行预扩增才能达到与qPCR相当的灵敏度（Ding等人，2020年；Pang等人，2020年；Zhang等人，2021年）。然而，一个主要挑战是核酸扩增和基于CRISPR的检测之间的反应条件不兼容，这需要将它们分为不同的步骤（Broughton等人，2020年）。因此，早期的CRISPR-Dx平台，如DNA内切酶靶向CRISPR报告系统（DETECTR）和一小时低成本多功能高效系统（HOLMES），被设计为两步顺序工作流程，包括初始扩增步骤，然后手动添加CRISPR组分（Chen等人，2018年；Li等人，2018年；Wang等人，2021年；Yin等人，2020年）。这种分段方法增加了操作复杂性，延长了总检测时间，并增加了气溶胶介导的核酸污染风险（Ding等人，2020年；Hu等人，2023年；Kellner等人，2019年）。为了解决这些问题，已经进行了不同的改进，以实现一步检测，如光激活CRISPR-Cas系统（Chen等人，2022年；Hu等人，2022年）、相分离方法（Uno等人，2023年）和次优原间隔基序（PAM）序列（Lu等人，2022年）。然而，这些方法不仅需要额外的试剂和严格的目标序列筛选，而且Cas酶活性受到抑制，导致反应效率降低和检测时间延长。另一种策略是基于物理隔离将扩增和CRISPR检测分隔在不同的微流控结构中，包括离心装置、压力驱动通道和毛细管网络（Yin等人，2024年；Zhang等人，2025年）。尽管原理上有前景，但这些系统受到复杂微通道设计、精密仪器和高制造成本的限制，最终限制了其实际应用和广泛采用。
在微流控技术中，基于微滴的检测方法代表了无扩增核酸检测的专用平台。通过将传统的批量反应分成单独的微反应器，它们大大减少了背景信号和基质抑制剂引起的干扰（Xu等人，2025年；Xue等人，2023年）。这种分隔有效地增加了这些微滴内的分子拥挤度，显著增强了反应信号，甚至能够在不进行扩增的情况下实现单分子检测（Tian等人，2021年；Yue等人，2021年）。虽然已经展示了基于微滴的CRISPR检测，但现有系统通常依赖于专门的微流控装置来生成均匀的微滴，限制了其可访问性（Liu等人，2022年；Shang等人，2024年）。尽管有一些基于CRISPR的微滴检测方法用于多重检测，但它们通常依赖于多酶策略，这增加了检测的复杂性和成本（Cheng等人，2025年；Wan等人，2024年）。此外，微滴的分析目前依赖于半自动软件，如ImageJ，引入了主观性和低通量。因此，推进CRISPR微滴技术的实际应用需要开发简化的多重策略，并结合自动化的客观图像分析。
在这里，我们报告了一种无需微流控技术和扩增的多分散数字微滴CRISPR/Cas12a（DD-Cas12a）平台，用于三种病原体核酸的同时多重数字检测。为了实现多重数字检测，微滴被编码了具有不同光谱特性的荧光报告分子，对应于特定的合成核酸目标。我们建立了算法驱动的DD-Cas12a（ADC）平台，以替代手动分析，实现快速和客观的信号解释。我们开发了一种微型仪器，用于便携式信号采集和现场检测。通过将DD-Cas12a检测方法与ADC平台和微型仪器相结合，我们建立了一个集成系统，用于便携式、数字化、无扩增且超灵敏的多病原体检测，在诊断和环境监测中具有巨大潜力。
部分摘录
化学物质和材料
所有DNA和RNA序列（表S1）均由Sangon Biotech合成和纯化，并用无RNase的水稀释。ABIL EM 180购自Evonik Industries。异丙基棕榈酸购自Macklin Biochemical。HiScript II Q RT SuperMix用于qPCR，购自Vazyme。EasyPure Simple Viral DNA/RNA Kit购自TransGen Biotech。10x NEBuffer2.1购自New England Biolabs。Cas12a蛋白来自实验室表达和纯化。DI-water
DD-Cas12a检测原理
传统单管CRISPR-Cas12a检测的一个关键限制是无法实现多重目标检测。这一限制源于激活的Cas12a固有的非特异性切割活性，它会在同一反应管中产生与多个目标特异性识别无关的荧光信号。为了克服这一挑战，开发了DD-Cas12a平台，将大量混合反应体积分隔成高密度微滴乳液，
结论
在这项工作中，我们报告了一种DD-Cas12a平台，通过用不同的荧光报告分子编码多分散微滴，实现了无需预扩增的多重检测，从而能够同时且特异性地检测PCV2、PEDV和PRRSV。我们的主要结果表明，该平台在40分钟内达到了低至0.15 fM的LOD，与传统批量检测方法相比，灵敏度提高了1.5×105倍。在复杂的细胞培养病毒样本中，其检测限达到了126.0，
CRediT作者贡献声明
季志润：撰写——原始草稿、方法学、正式分析。黄俊康：软件。赵一然：研究、概念化。刘飞：监督、资金获取。李家豪：方法学。单彦凯：资金获取。吴明辉：撰写——审阅与编辑。黄庆华：软件
未引用的参考文献
Ding等人，2020年；Li等人，2018年。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢湖南省重点研发项目（编号2023NK2017）、中央高校基本科研业务费（编号090-ZJ25195024）、国家自然科学基金（编号22304071）和国家重点研发计划（编号2023YFD1800502）的财政支持。
