《Current Opinion in Chemical Biology》：Photocatalytic proximity labeling in primary samples
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这篇综述系统总结了光催化邻近标记(PPL)这一新兴技术在原始生物样品（包括原代细胞、组织和临床样本）中的最新应用进展。作为一种无需遗传操作的非基因策略，PPL利用小分子光催化剂在光照下激活标记探针，实现了对近端生物分子具有时空可控性的共价标记，为在原生生理状态下解析蛋白质相互作用网络、细胞间通讯及亚细胞器蛋白质组学提供了强大工具，推动了转化医学研究。
引言
生物系统的功能依赖于高度有序的分子和细胞相互作用网络。原始样品，如新鲜分离的细胞、组织和临床样本，能更好地保留原生生理状态和微环境，是研究体内条件的理想模型。邻近标记技术已成为在活体系统中绘制生物分子组成和相互作用网络的强大工具。然而，传统的酶基PL方法（如BioID、TurboID、APEX）依赖于基因操作来表达酶-靶点融合蛋白，这在应用于原代样本时面临重大挑战，如转染困难、表达时间窗口有限以及酶分子（28-44 kDa）的空间位阻可能干扰靶蛋白的天然相互作用。
光催化邻近标记作为一种替代策略应运而生，它用小分子光催化剂替代酶催化剂，在光照下驱动标记反应。其核心优势在于无需基因操作，并可通过外部光照实现精确的时间控制，催化剂靶向和活性中间体寿命则为调节空间分辨率提供了可能，使其特别适用于原始生物环境的直接研究。
原始样品中细胞表面蛋白质相互作用的光催化分析
细胞膜蛋白相互作用是细胞生物学的核心，也是主要的治疗靶点类别。膜蛋白可从细胞外空间直接接近，便于通过抗体或纳米抗体结合实现光催化剂的精确靶向，这使其特别适合PPL研究。
2020年，Geri等人报道了μMap平台，它通过抗体结合铱光催化剂，蓝光激活重氮甲烷探针产生短寿命的卡宾中间体，实现对膜蛋白微环境的高分辨率标记。2024年，Lin等人推出了MultiMap多尺度PPL平台，利用曙红作为光催化剂，在绿光下激活三种不同的探针，实现了从蛋白质近邻到跨细胞距离的连续空间范围标记。
为了在更生理相关的条件下进行标记，Takato等人于2025年报道了PhoxID技术，它使用亲水性单溴荧光素作为光催化剂，通过配体导向化学将其锚定在小鼠脑内的靶蛋白上。绿光照射下，MBF产生单线态氧，氧化附近蛋白质，从而实现体内神经递质受体（如AMPAR和GABAAR）相关邻近蛋白质组的分析。
为克服短波长激发光的穿透限制，研究转向开发红光和深红光响应系统。2022年，Buksh等人开发了μMap-Red，使用氯e6衍生的锡光催化剂，红光激活芳基叠氮化物探针，成功分析了小鼠全血样本中的红细胞膜蛋白。Tay等人则引入了锇基光催化剂，在深红光下激活探针，应用于三维球体培养物和小鼠肿瘤异种移植组织。最近，Tong等人报道了一种红光激发的氯e6平台，可激活具有不同标记半径的探针，并应用于人胶质母细胞瘤原代样本，揭示了EGFR相关相互作用网络的区域异质性。
PPL技术甚至扩展到了福尔马林固定石蜡包埋的临床样本。2025年，Bissonnette等人提出了μMap-FFPE策略，结合热稳定生物素-苯胺探针和红光激发的锡光催化剂，在淋巴瘤FFPE样本中成功标记了CD20及其相关蛋白。
原始样品中的亚细胞细胞器蛋白质组学
PPL在细胞内的应用也于21世纪20年代初开始兴起。例如，Tamura等人报道了基于二溴荧光素/苯胺对通过单线态氧化学实现的核蛋白标记，Wang等人则开发了使用罗丹明123/叠氮苯对产生三线态氮宾中间体的线粒体标记策略。
同期，CAT-Prox作为一种基于铱光催化剂和叠氮苄基探针的线粒体蛋白质标记策略被报道，它能在光激活下产生醌甲基化物中间体。然而，当扩展到原始样本时，CAT-Prox表现出降低的线粒体特异性，这凸显了原生组织复杂性和异质性带来的额外挑战。
通过系统优化醌甲基化物探针化学，我们开发了CAT-S平台，它采用反应性更强的硫代醌甲基化物弹头来增强标记效率和特异性。CAT-S成功应用于原代小鼠组织和人外周血单个核细胞样本的线粒体蛋白质组学分析。将其应用于肥胖的II型糖尿病小鼠肾脏，揭示了与健康对照组相比线粒体蛋白质组的明显改变。
在CAT-S基础上，我们进一步将光催化标记从蛋白质扩展到核酸，开发了CAT-seq。该策略采用对胞嘧啶具有选择性的醌甲基化物探针，实现了对线粒体RNA的优先标记。后续引入的CAT-ortho扩展，允许使用两种化学性质不同的醌甲基化物探针同步、选择性地标记线粒体RNA和蛋白质。这种同步多组学方法应用于原代小鼠T细胞，揭示了T细胞成熟过程中线粒体的协调重塑。
除了线粒体，PPL策略已逐步适应其他亚细胞区室，如溶酶体、内质网、高尔基体和蛋白质聚集体。尽管这些方法在原始样本中的应用仍然相对有限，但其非遗传实施和精确的时空控制特性，使其在解析原生生物环境中细胞器分辨的蛋白质组动力学方面具有吸引力。
探测原始样品中的细胞间相互作用
细胞间相互作用在免疫调节、肿瘤微环境组织和组织发育中起着核心作用。PPL作为一种化学策略，可通过光控制将物理性的细胞间接触转化为稳定的分子读数，从而以空间和时间精度探究细胞间通讯。
2022年，Oslund等人报道了PhoTag，它使用类黄素光催化剂产生苯氧自由基，选择性标记免疫突触处的蛋白质。Liu等人则引入了PhoXCELL，其中二溴荧光素被掺入树突状细胞膜，绿光激发下产生单线态氧，氧化相邻T细胞上的蛋白质，从而检测小鼠肿瘤模型中的肿瘤抗原特异性T细胞。
为了进一步使PPL适应细胞间标记，2024年开发了CAT-Cell平台，通过化学调节醌甲基化物探针的有效标记半径来实现。该方法能够检测原始样本中肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。对对叠氮苄基-醌甲基化物探针的系统修饰进一步证明，探针结构可用于调节不同空间区域的标记行为。
为了将CCIs分析扩展到完整组织环境中，2025年开发了深红光驱动的CAT-Tissue策略。在该系统中，氯e6光催化剂与纳米抗体结合，实现活肿瘤组织切片内的靶向递送。当与批量RNA测序整合时，CAT-Tissue揭示了靠近肿瘤细胞的CD8+T细胞表现出活化、效应和耗竭的表型。利用类似的深红光PPL策略结合单细胞测序，后续研究实现了在活体小鼠中直接捕获和分析CCIs，揭示了LAG3–MHC II相互作用的稳定性。
除了分析应用，光催化邻近化学也开始被探索用于通过细胞表面的局部化学修饰来主动调节CCIs。2025年，Li等人报道了PATCH技术，它采用含有卟啉和锆组分的多孔配位网络纳米颗粒作为纳米酶光催化剂。该系统集成了深红光驱动的苯氧自由基化学用于酪氨酸修饰，以及超声波触发的单线态氧生成用于组氨酸修饰，从而在肿瘤相关抗原附近实现局部、密集的荧光素标记。研究表明，在患者来源的类器官和肿瘤片段模型以及多种小鼠肿瘤模型中，该技术均能引发强大的抗肿瘤反应和持久的免疫激活。
总结与展望
对原始样品的直接研究对于理解原生生理和病理背景下的生物过程越来越被视为至关重要。光催化邻近标记的出现提供了一个及时且有前景的机会来克服这些限制。通过用小分子光催化剂替代基因编码的酶，并使用外部光作为触发器，PPL提供了一种非遗传的、时间门控的、空间可控的方法，特别适合原始样品的直接分析。
尽管PPL技术前景广阔，但针对原始样本的系统性评估和广泛应用仍处于早期阶段。这反映了原始样本对效率、特异性和鲁棒性提出的更高要求。从机理上讲，不同的PPL化学反应会产生具有不同扩散行为和有效标记半径的活性中间体，直接影响复杂原生环境中的空间精度和背景标记。光照射也是一个实际考虑因素。较短的波长可能被内源性发色团吸收，导致意外的光化学应激，而较长波长的照射在较高功率下可能引入光热效应。实际上，大多数报道的PPL方案采用低光功率和短暂照射时间以最大限度地减少光毒性。
展望未来，尽管光催化邻近标记技术才建立几年，但它已经展现出强大的时空可控性和广泛的概念多功能性。反应化学、光催化剂设计、长波长激活和靶向策略的持续进步，有望产生更成熟、更用户友好的化学工具包。随着这些技术的发展，PPL将能够实现对原生生物系统的直接、多尺度研究，为理解细胞组织、组织水平通讯和疾病相关重塑提供关键见解。
