《BMC Genomics》：An improved Agrobacterium-mediated transformation method for genome editing using CRISPR/Cas9 in elite indica rice (Oryza sativa L.)
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针对籼稻品种农杆菌介导转化效率低下的难题，研究人员优化了基于CRISPR/Cas9系统的转化方案。该研究在Lalat和MTU-1010两个籼稻品种中建立并验证了方案，利用种子来源的胚性愈伤组织，通过携带gRNA和筛选标记hptII的CRISPR/Cas9载体，成功编辑了热敏感型雄性不育基因OsTMS5。结果表明，该方案显著提高了愈伤诱导与植株再生效率，并最终获得了较高的转化效率（Lalat为37.20%，MTU-1010为29.62%）。这项研究为水稻基因功能解析和性状精准改良提供了一个稳定高效的技术平台，有望加速水稻的产量提升和逆境耐受性改良进程。
水稻，这个养活了全球近半数人口的古老作物，正面临着一场前所未有的气候危机。随着全球气候变化加剧，干旱、高温、盐碱等极端环境胁迫频繁发生，对水稻的生产力构成了严重威胁。保障全球粮食安全，迫切需要培育出能够抵抗这些逆境、稳产高产的新品种。传统的育种方法耗时漫长，且难以实现精准的性状改良。幸运的是，基因组编辑技术的兴起，特别是CRISPR/Cas（规律成簇的间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统，以其前所未有的精准性、高效性和可扩展性，为作物改良带来了革命性的新工具。
然而，将这把“基因剪刀”有效地送入水稻细胞，尤其是在遗传转化难度更大的籼稻品种中，却是一大技术瓶颈。农杆菌介导的转化是目前植物转基因和基因编辑的主流方法，但其转化效率在籼稻中普遍较低，这严重制约了籼稻的基因功能研究和性状编辑应用。于是，一个关键的科学问题摆在了研究人员面前：能否通过优化转化流程，建立一套高效、稳定、适用于不同籼稻品种的CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系，从而为籼稻的精准育种铺平道路？
为了回答这一问题，一项题为“一种改进的农杆菌介导转化方法用于优良籼稻（Oryza sativa L.）中基于CRISPR/Cas9的基因组编辑”的研究在《BMC Genomics》上发表。该研究瞄准了籼稻转化效率低的痛点，以两个优良籼稻品种Lalat和MTU-1010为材料，系统地优化了从外植体诱导、农杆菌侵染到植株再生的整个转化流程。研究人员选择热敏感型雄性不育基因OsTMS5作为编辑靶点，旨在验证所建立技术体系的有效性。他们构建了携带特异性引导RNA（gRNA）和潮霉素磷酸转移酶（hptII）筛选标记的CRISPR/Cas9编辑载体，通过农杆菌将其导入由水稻种子诱导产生的胚性愈伤组织中。经过精细调控的培养基配方（如添加特定浓度的2,4-D、BAP、NAA和激动素等植物生长调节剂），研究者成功实现了高比例的愈伤组织诱导和植株再生。最终，通过聚合酶链式反应（PCR）分析证实了外源基因的整合，并计算出了可观的转化效率。这项研究成功建立了一套高效的籼稻基因组编辑技术平台，不仅为深入解析水稻基因功能提供了有力工具，更将加速籼稻在产量、品质及抗逆性等方面的遗传改良进程，为应对气候变化下的粮食安全挑战提供了重要的技术方案。
本研究主要应用了以下几项关键技术方法：1. 农杆菌介导的遗传转化：利用根癌农杆菌将构建好的CRISPR/Cas9编辑载体递送至水稻细胞。2. 植物组织培养：以水稻成熟种子为起始材料，在含有特定植物生长调节剂的MS（Murashige and Skoog）培养基上，依次进行胚性愈伤组织的诱导、农杆菌共培养、抗性愈伤筛选以及再生植株的分化与生根。3. CRISPR/Cas9基因组编辑技术：针对OsTMS5基因设计并构建了包含Cas9蛋白编码序列和靶向gRNA表达盒的编辑载体。4. 分子鉴定技术：通过PCR技术对再生植株进行检测，以验证外源T-DNA（转移DNA）片段是否成功整合到植物基因组中。
研究结果
高效的愈伤组织诱导与植株再生体系的建立
为了获得高质量的转基因受体材料，研究人员首先优化了愈伤组织的诱导条件。他们发现，在添加了3 mg/L 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）和0.5 mg/L BAP（6-苄氨基嘌呤）的MS培养基上，两个籼稻品种均表现出极高的愈伤诱导率。其中，MTU-1010的诱导率达到了96.87%，而Lalat的诱导率也高达93.30%。这为后续的遗传转化提供了充足且状态良好的实验材料。在植株再生阶段，研究采用了含有0.25 mg/L NAA（萘乙酸）、0.5 mg/L 激动素（kinetin）和2 mg/L BAP的MS培养基。结果显示，Lalat品种的再生效率（90.28%）略高于MTU-1010（87.51%）。这些数据表明，本研究建立的培养体系能够有效地支持籼稻胚性愈伤组织的形成以及从愈伤到完整植株的再分化过程。
CRISPR/Cas9载体构建与遗传转化
研究构建了一个用于编辑OsTMS5基因的CRISPR/Cas9二元载体。该载体除了含有Cas9核酸酶基因和针对OsTMS5的gRNA表达单元外，还携带了由潮霉素抗性基因（hptII）驱动的植物筛选标记，用于在组织培养阶段筛选成功转化的细胞。研究人员利用优化后的农杆菌菌株，将上述载体导入到前述诱导出的胚性愈伤组织中。经过共培养、清洗和在选择培养基上（含潮霉素）的多次筛选，获得了抗性愈伤组织。这些抗性愈伤进一步在再生培养基上培养，最终分化出了绿色的再生小苗。
转基因事件的分子验证与转化效率计算
为了确认外源基因是否成功整合到水稻基因组中，研究人员对再生植株进行了PCR分析。他们使用针对hptII基因的特异性引物对DNA样本进行扩增，在预期的片段大小处检测到了特异条带，这从分子水平证实了T-DNA已整合到水稻的基因组中。基于抗性愈伤获得率和PCR阳性率，研究最终计算出了本优化方法的实际转化效率。数据显示，在Lalat品种中，转化效率为37.20%；在MTU-1010品种中，转化效率为29.62%。这一效率显著高于以往许多关于籼稻农杆菌转化的报道，证明了本优化方案的有效性和优越性。
结论与讨论
本研究成功建立并优化了一套适用于优良籼稻品种的高效农杆菌介导的CRISPR/Cas9转化体系。该体系的核心优势在于，通过精细调整愈伤诱导和植株再生培养基中的植物生长调节剂组合与浓度，显著提升了籼稻胚性愈伤组织的发生质量和植株再生能力，从而为高效的遗传转化奠定了坚实基础。以OsTMS5基因为编辑靶点的成功案例，充分验证了该技术平台在实现水稻基因精准敲除方面的可行性与有效性。
这项研究成果具有多重重要意义。首先，在技术层面，它直接攻克了籼稻转化效率低下的关键瓶颈，为籼稻功能基因组学研究提供了一个可靠、高效的标准化操作方案。研究者可以参照此流程，快速地将CRISPR/Cas9系统应用于其他重要农艺性状相关基因的编辑。其次，在应用层面，该技术极大地加速了籼稻的分子设计育种进程。借助此平台，育种家能够更快速、更精准地改良水稻的产量、品质、生物与非生物胁迫耐受性等复杂性状，例如培育抗旱、耐盐、抗病的新品种。最后，在全球粮食安全层面，此项研究为应对气候变化对水稻生产的威胁提供了有力的技术武器。通过精准编辑，有望在更短的时间内培育出适应未来恶劣环境的高产稳产品种，从而为保障全球，特别是以稻米为主食地区的人口粮食安全做出实质性贡献。总之，本研究开发的优化转化协议，不仅是一个强大的基础研究工具，更是一座连接基因编辑技术与籼稻育种应用的坚实桥梁，具有广阔的推广前景和重要的战略价值。
