利用CRISPR/Cas9技术敲除NAD依赖性乳酸脱氢酶，从而改变Lactaseibacillus paracasei NC4菌株中乳酸的立体选择性生成

《Biochemical Genetics》：CRISPR/Cas9-Mediated Knockout of the NAD-Dependent Lactate Dehydrogenases for Altered Stereospecific Lactic Acid Production in Lacticaseibacillus paracasei NC4

CRISPR/Cas9介导的乳酸菌基因敲除研究揭示了ldh1和ldh2对L-和D-乳酸立体特异性合成的调控作用。通过构建Δldh1、Δldh2和双突变株，发现Δldh2完全抑制D-乳酸生成，而Δldh1仅降低L-乳酸含量且无法消除D-乳酸。该成果为高光学纯度乳酸生物合成工艺优化提供了遗传学依据。

　　

摘要

乳酸的光学纯度是生产高性能聚乳酸（PLA）的关键参数。为了研究乳酸立体特异性生物合成的遗传基础，本研究旨在通过靶向基因敲除技术，功能性地分析ldh1和ldh2在Lacticaseibacillus paracasei NC4中的作用。本研究采用了基于CRISPR/Cas9系统的 nickase 来构建三种突变菌株（Δldh1、Δldh2 和 Δldh1Δldh2）。在相同的条件下进行发酵实验，并使用 HPLC 测量 D-乳酸和 L-乳酸的浓度。利用 CRISPR-Cas9 系统成功从野生型 NC4 中构建了三种突变菌株：Δldh1、Δldh2 和 Δldh1Δldh2。与野生型 NC4（产生 89.31 ± 0.21 g/L 的 L-乳酸和 10.74 ± 0.19 g/L 的 D-乳酸）相比，Δldh1 突变菌株产生的 L-乳酸为 76.31 ± 2.22 g/L，D-乳酸为 7.72 ± 0.36 g/L；Δldh2 突变菌株产生的 L-乳酸为 81.73 ± 0.46 g/L，而 D-乳酸未检测到；Δldh1Δldh2 双突变菌株产生的 L-乳酸为 75.57 ± 2.96 g/L，D-乳酸同样未检测到。这些结果表明，靶向删除 ldh 基因显著改变了乳酸生物合成的立体特异性。特别是，删除 ldh2 足以消除可检测到的 D-乳酸生成，而单独删除 ldh1 并不能完全阻止 D-乳酸的产生。总体而言，本研究为 L. paracasei NC4 中 ldh1 和 ldh2 在控制乳酸立体特异性方面的作用提供了功能性的遗传学见解，并为未来基于代谢和工艺优化的光学纯乳酸生产奠定了遗传基础。

图形摘要

乳酸的光学纯度是生产高性能聚乳酸（PLA）的关键参数。为了研究乳酸立体特异性生物合成的遗传基础，本研究旨在通过靶向基因敲除技术，功能性地分析ldh1和ldh2在Lacticaseibacillus paracasei NC4中的作用。本研究采用了基于CRISPR/Cas9系统的 nickase 来构建三种突变菌株（Δldh1、Δldh2 和 Δldh1Δldh2）。在相同的条件下进行发酵实验，并使用 HPLC 测量 D-乳酸和 L-乳酸的浓度。利用 CRISPR-Cas9 系统成功从野生型 NC4 中构建了三种突变菌株：Δldh1、Δldh2 和 Δldh1Δldh2。与野生型 NC4（产生 89.31 ± 0.21 g/L 的 L-乳酸和 10.74 ± 0.19 g/L 的 D-乳酸）相比，Δldh1 突变菌株产生的 L-乳酸为 76.31 ± 2.22 g/L，D-乳酸为 7.72 ± 0.36 g/L；Δldh2 突变菌株产生的 L-乳酸为 81.73 ± 0.46 g/L，而 D-乳酸未检测到；Δldh1Δldh2 双突变菌株产生的 L-乳酸为 75.57 ± 2.96 g/L，D-乳酸同样未检测到。这些结果表明，靶向删除 ldh 基因显著改变了乳酸生物合成的立体特异性。特别是，删除 ldh2 足以消除可检测到的 D-乳酸生成，而单独删除 ldh1 并不能完全阻止 D-乳酸的产生。总体而言，本研究为 L. paracasei NC4 中 ldh1 和 ldh2 在控制乳酸立体特异性方面的作用提供了功能性的遗传学见解，并为未来基于代谢和工艺优化的光学纯乳酸生产奠定了遗传基础。

图形摘要