《RSC Advances》：Potential screening of oral squamous cell carcinoma using microRNA geno-assay by electrochemical sensing: a new platform in biosensor technology
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）作为全球范围内导致死亡的重要疾病之一，其早期诊断对于降低发病负担和死亡率至关重要。由于microRNA-423-5p在受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic, ROC）中表现出较高特异性，因此被选作OSCC有效识别的标志物，从而能够对人类生物流体中的口腔癌（oral cancer, OC）进行精确诊断。本研究提出了一种新型无标记（label-free）电化学平台，用于在人唾液样本中无创识别microRNA-423-5p。该监测过程通过基于DNA的生物分析方法实现。为达到这一目的，研究人员首先在玻碳电极（glassy carbon electrode, GCE）表面电聚合形成聚壳聚糖〔polychitosan, P(CS)〕，并将其作为GCE表面的高效捕获层。同时，采用三角形银纳米颗粒（triangular silver nanoparticles, TA-AgNPs）实现探针DNA（probe-DNA）的稳定固定。借助TA-AgNPs与巯基化DNA序列之间的相互作用，可有效固定巯基化DNA序列。该固定过程通过DNA-microRNA-423-5p杂交策略实现。因此，构建了一种无标记基因传感器（genosensor），用于对OC进行灵敏识别。采用电分析方法，在人唾液样本中测得microRNA-423-5p的线性范围为1 pM至5 nM，定量下限（low limit of quantification, LLOQ）低至1 pM。由于该研究是首次将电分析策略应用于OC生物标志物microRNA-423-5p的识别，因此为癌症诊断开辟了新的前景。
该论文发表于《RSC Advances》，围绕口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）早期筛查中无创生物标志物检测的需求，构建了一种面向唾液样本的无标记电化学基因传感平台。研究背景在于，OSCC是头颈部常见恶性肿瘤之一，临床预后与诊断时机密切相关。早期病例五年生存率较高，而进展期病例生存率显著下降，提示早诊早筛是降低疾病负担的关键。然而，现有口腔病变筛查方式如肉眼检查、组织荧光成像和光学相干断层扫描等，虽具有一定应用价值，但在临床推广中仍受到特异性不足、临床验证有限以及与活检结果关联不充分等因素制约。与此同时，非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），尤其是microRNA（miRNA）作为肿瘤发生发展中的关键调控分子，在口腔癌诊断中展现出较高潜力。唾液作为一种可无创获取的生物样本，兼具采集便捷、储运成本低、患者依从性高等优点，因此被视为适合口腔癌筛查的理想检测介质。基于既往研究中microRNA-423-5p在受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic, ROC）中的优异诊断性能，研究人员选择该分子作为口腔癌检测靶标。
在此基础上，研究人员设计并建立了一种基于DNA杂交的无标记电化学基因传感器，用于在人类唾液中灵敏、特异地识别microRNA-423-5p。该研究的核心目标是构建首个专门用于microRNA-423-5p检测的生物传感器，并将其应用于口腔癌相关标志物的无创检测。研究结果表明，该传感器可在标准体系及真实生物样本中实现microRNA-423-5p检测，并具有较好的选择性、重复性及一定应用可行性。论文的重要意义在于提出了一种将唾液生物标志物、电化学检测与核酸杂交识别相结合的新型分析平台，为口腔癌早期无创筛查提供了新的技术路径。
就主要技术方法而言，研究人员首先通过循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）在玻碳电极表面电聚合形成聚壳聚糖层P(CS)；随后引入KCC-1-nPr-NH-Arg与三角形银纳米颗粒（TA-AgNPs）构建有利于探针DNA固定的复合界面；再通过巯基化探针DNA与靶microRNA-423-5p之间的核酸杂交构建无标记基因传感器。电极构建过程采用场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscopy, FE-SEM）和能量色散X射线谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX）表征，分析检测主要采用CV和差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry, DPV）。真实样本部分包括伊朗Tabriz University of Medical Sciences提供的人唾液和人血浆样本，并取得伦理审批及知情同意。
以下结合论文主体对研究内容进行分节解读。
Introduction
引言部分系统阐述了开展本研究的现实依据。研究人员指出，OSCC是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，而诊断延迟是导致其五年生存率偏低的重要原因。大量病例在晚期才被发现，因此亟需能够区分癌性与非癌性病变、并支持早期识别的筛查工具。作者进一步指出，唾液组学（salivaomics）研究的发展，使唾液中的核酸和蛋白标志物检测成为可能。既往研究显示，OSCC患者唾液中若干miRNA表达异常，其中microRNA-423-5p具有较高诊断价值，且与无病生存期（disease-free survival, DFS）存在关联。基于这一前提，研究人员提出利用电化学生物传感策略实现对该miRNA的快速、无创检测。
Electropolymerization of CS on the surface of the GCE
在该部分中，研究人员说明了聚壳聚糖层P(CS)的制备基础。壳聚糖（chitosan, CS）具有良好黏附性、低毒性、较高渗透性和成膜能力，因此适于生物传感界面构建。研究中采用CV法在预处理玻碳电极表面进行20圈扫描，实现CS电聚合，电位范围为?0.6至+1.3 V。该步骤的目的在于形成稳定的高电位捕获层，为后续纳米材料和核酸探针的负载提供基础界面。
Synthesis and characterization of KCC-1-nPr-NH-Arg and triangular silver nanoprism (TA-AgNPr)
本部分介绍了复合纳米界面的组成。研究人员采用既往方法制备KCC-1-nPr-NH-Arg，并将其修饰于GCE-P(CS)表面，以提高表面积/体积比并增强DNA负载能力。随后使用三角形银纳米棱柱（TA-AgNPr）促进巯基化DNA探针的稳定固定。该设计体现出材料工程与核酸识别界面的结合思路，为后续高效杂交检测奠定结构基础。
Fabrication of genosensor
在基因传感器构建部分，研究人员依次完成P(CS)电聚合、KCC-1-nPr-NH-Arg/AgNPs复合修饰以及特异性DNA探针固定。探针DNA在4 °C孵育12小时后稳定固定于电极表面，再以牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）封闭非特异性位点，最后加入microRNA-423-5p于37 °C孵育30分钟完成杂交。由此形成GCE/P(CS)/KCC-1-nPr-NH-Arg/AgNPs/probeDNA/BSA/microRNA-423-5p检测界面，构成完整无标记基因传感器。
Characterization of different steps of sensor fabrication using FE-SEM and EDX
该部分利用FE-SEM与EDX验证传感器逐步组装的成功性。P(CS)层表现出较规整的结构化形貌；引入KCC-1-nPr-NH-Arg后，电极表面出现类似“蘑菇状”突起；继续修饰Ag纳米颗粒后，可见棱柱形纳米结构；固定巯基DNA后，表面转为海绵状特征；在与microRNA-423-5p杂交后，界面形貌进一步变化。EDX结果则从元素组成角度支持了多步修饰和传感器构建的有效完成。该部分结论是：所设计电极界面在形貌和成分层面均显示出逐层成功组装的证据。
Electrochemical behavior of the designed genosensor
该部分通过CV和DPV考察传感器各构建阶段的电化学行为。结果显示，P(CS)修饰后阳极峰电流下降，说明聚合物层对电子转移具有一定阻碍作用；引入KCC-1-nPr-NH-Arg后，因其表面多功能基团和结构特性，峰电流明显升高；加入AgNPs后，电流有所下降，作者将其归因于Ag纳米棱柱嵌入KCC-1-nPr-NH-Arg多孔结构；固定probe DNA后，电流进一步降低；当probe DNA与microRNA-423-5p发生杂交后，Fe(CN)
63?/4?氧化还原峰显著减小。研究人员认为，该变化源于ssDNA与dsDNA积累带来的空间位阻及负电荷排斥效应，证明杂交事件成功发生。DPV所得趋势与CV一致，从而共同证实所构建界面的识别机制与电信号转导逻辑成立。
Analytical studies
分析性能研究部分主要评估传感器对microRNA-423-5p的定量检测能力。研究人员采用DPV对不同浓度靶标进行测定，结果表明，校准曲线峰电流与microRNA-423-5p浓度的自然对数变化具有相关性。标准溶液中的检测范围覆盖1 pM至5 nM，说明该装置能够对低丰度microRNA-423-5p进行灵敏检测。该部分得出的核心结论是，所构建无标记基因传感器具备良好的定量分析能力。
Analytical studies in real samples (human blood plasma)
在血浆真实样本研究中，研究人员将不同浓度microRNA-423-5p加标至人血浆样本后进行检测。结果显示，在0.001至0.1 nM范围内，DPV响应与浓度呈良好线性关系，回归方程为I(μA) = 171.52 C
microRNA-423-5p + 29.74，R
2 = 0.9381，灵敏度为171.52 μA nM
?1，LLOQ为1 pM。该部分说明，所设计电极不仅适用于标准体系，也可用于血浆加标样本中的microRNA-423-5p检测。
Analytical study
在唾液样本分析中，研究人员采用未处理健康人唾液样本进行加标检测，以验证其用于无创筛查的可能性。结果显示，在0.01至1 nM范围内，回归方程为I(μA) = 6.0081 C
microRNA-423-5p + 8.2013，R
2 = 0.9641，灵敏度为6.0081 μA nM
?1，LLOQ为0.01 nM。该部分结论是，该传感器能够在真实唾液样本中检测microRNA-423-5p，支持其作为口腔癌无创筛查工具的潜在应用价值。
Selectivity of the genosensor
选择性研究采用非互补序列（ncDNA）和1碱基错配序列作为干扰对照。结果显示，microRNA-423-5p、ncDNA与1碱基错配序列对应的电流强度分别为8.48、9.71和10.39 μA。研究人员据此认为，所构建生物传感器对目标microRNA-423-5p具有选择性识别能力。该部分的意义在于证明该传感体系具备一定序列分辨能力。
Repeatability of the biosensor
重复性评价通过三次平行测定完成。不同浓度条件下测量结果的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）约为4%–5%，低于生物样本分析中通常可接受范围。研究人员据此指出，该基因传感器具有较好的重复性，同时反映其制备流程具有可再现性。
Evaluation of the stability
稳定性评价包括日内稳定性与日间稳定性两个方面。日内表面稳定性结果显示，不含生物识别元件的P(CS)/KCC-1-nPr-NH-Arg修饰电极在约3小时内可保持接近50 μA的稳定电流，自第3小时后开始下降。日间稳定性结果显示，该基质在第1天保持稳定，而到第2天电流显著降至约7 μA。上述结果表明，该电极基质适于较短时间窗口内使用，传感器制备完成后应尽快投入检测。
Cyclic stability of sensor substrate
循环稳定性研究通过连续10个CV循环评估修饰电极在重复扫描中的保持能力。结果表明，前5个循环中峰电流基本维持在约50 μA，而至第10个循环下降至32.31 μA。由此可见，该修饰电极作为生物传感基底在前5次使用中性能较优，之后稳定性下降较明显。
讨论部分可概括为：研究人员通过材料界面工程与核酸杂交识别相结合，建立了一个面向OSCC相关miRNA检测的无标记电化学平台。P(CS)提供了稳定捕获层，KCC-1-nPr-NH-Arg增加了表面负载能力，TA-AgNPs促进了巯基化DNA的稳固固定，而DNA-microRNA杂交则实现了目标识别与电信号变化的耦合。多种表征和电化学测试共同支持该平台构建成功。该体系在标准溶液、人血浆和人唾液中均显示出检测microRNA-423-5p的可行性，并表现出一定选择性、重复性和短期稳定性。整体而言，论文的讨论重点在于证明该平台可作为口腔癌无创电化学筛查的一种新方案。
研究结论部分可译为：综上，研究人员开发了一种创新性的无标记电化学基因传感器，用于对microRNA-423-5p进行灵敏且特异的识别。该研究首次采用DNA杂交策略监测人类生物流体中与口腔癌相关的目标生物标志物。借助所开发的生物传感器，实现了在人唾液样本中对microRNA-423-5p的无创分析，其线性范围为1 pM至5 nM。该生物器件的构建采用了KCC-1-nPr-NH-Arg、TA-AgNPs和P(CS)等新型材料。最终，利用该工程化生物分析传感器，在存在ncDNA和错配DNA等干扰物种的条件下，实现了对microRNA-423-5p的特异性检测。所构建的生物传感器具有显著优势，可作为一种可行的电化学装置用于检测人类生物流体中的microRNA-423-5p，并为口腔癌的早期检测开辟了新的可能性。
