《Journal of Extracellular Vesicles》：Distinguishing Pseudotransduction and True Transduction Enables Characterization and Bioengineering of Extracellular Vesicle-Adeno-Associated Virus Vectors
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本研究针对评价工程化胞外囊泡-腺相关病毒（EV-AAV）载体时难以区分“伪转导”与“真转导”的关键技术难题，开发了一种基于Cre重组酶的双报告基因系统。利用该系统，研究人员系统探究了不同EV表面修饰（如VSV-G、Ultra-HEK）对EV-AAV在HEK293FT和Jurkat T细胞中介导的混合递送与转导效率的影响。研究发现，增强EV摄取和膜融合的效果是受者细胞类型依赖性的，为理解EV-AAV的递送机制、指导其未来的生物工程应用提供了新的见解和方法学基础。
腺相关病毒（AAV）基因疗法在治疗遗传性疾病方面展现出巨大前景，已有多个产品获得监管批准。然而，当前AAV疗法仍面临一些挑战，例如预先存在的抗衣壳免疫、需要精确控制靶向性和嗜性，以及为提高疗效而增加载体剂量可能带来的不良反应风险。近年来，一种新兴的策略是将AAV载体包裹在工程化的胞外囊泡（EVs）内部，形成EV-AAV复合载体。这种“披着EV外衣”的AAV被认为有可能帮助克服上述难题，例如提高穿过血脑屏障的能力、抵抗中和抗体、并可能通过修饰EV表面来实现靶向递送。临床前研究也显示，EV-AAV在多种疾病模型中优于传统的“裸露”AAV。
但是，这个充满希望的领域仍处于早期发展阶段。科学家们对EV-AAV的作用机制还有许多不清楚的地方。例如，在EV表面添加功能蛋白（如病毒糖蛋白VSV-G）以增强与靶细胞的结合和摄取，究竟会如何影响最终的基因递送效率？不同研究的结果甚至存在矛盾。更关键的一个技术“拦路虎”是：如何准确区分“真转导”和“伪转导”？所谓“伪转导”，是指EVs将生产细胞中已合成的报告蛋白或其mRNA递送到受体细胞中，导致荧光信号，但这并非由AAV载体在受体细胞中成功转入并表达基因所致。这种“假阳性”信号会严重干扰对EV-AAV递送效率的真实评估，特别是在EV-AAV通常需要比慢病毒更高剂量才能达到可比转导效率的情况下，区分两者变得尤为紧要。为了解决这些问题，并深入理解EV-AAV的递送机制以指导其生物工程改造，研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles》上发表了这项研究。
为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法。首先是分子克隆与质粒构建，用于组装Cre响应型的AAV载体基因组（在Cre作用下可从表达红色荧光蛋白mCherry切换为表达绿色荧光蛋白mNeonGreen或eGFP）以及各种EV表面修饰蛋白（如VSV-G及其突变体、Ultra-HEK）的表达质粒。其次是细胞培养与工程化细胞系构建，使用Freestyle 293-F细胞作为EV-AAV的生产细胞，通过PEI转染共转染AAV包装质粒、辅助质粒及表面蛋白质粒来生产EV-AAV；通过慢病毒转导构建了稳定表达Cre重组酶的HEK293FT和Jurkat T细胞系作为受体细胞。第三是EV-AAV的制备与纯化，通过差速离心结合切向流过滤浓缩细胞培养上清，再通过尺寸排阻色谱法（SEC）或碘克沙醇密度梯度离心法纯化EV-AAV，以去除游离的AAV和蛋白。最后是功能分析与表征，通过流式细胞术定量分析混合递送（mCherry信号）和真转导（mNeonGreen信号），并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质印迹法（Western blot）和透射电子显微镜（TEM）对制备的EVs进行表征。
3.1 区分EV-AAV的伪转导与转导具有挑战性
研究人员首先试图量化EV-AAV递送中伪转导的幅度和动态。他们使用表达明亮荧光蛋白LumiScarlet的AAV载体，制备了EV-AAV和游离AAV，并以不含Rep/Cap基因的EVs作为伪转导对照。将纯化后的载体按基因组数剂量标准化后递送至HEK293FT细胞，并通过流式细胞术和显微镜在7天内监测荧光。结果显示，无论采用碘克沙醇梯度纯化还是尺寸排阻色谱纯化，EV-AAV所赋予的荧光与伪转导对照（No Rep/Cap EVs）在大多数时间点都难以区分，而游离AAV2则能赋予显著更高的荧光。显微镜观察发现，EV处理的细胞中可见荧光斑点（可能是内体中积累的多个EVs），而真正的转导（在整个细胞中呈现弥散、明亮的荧光）直到第7天才在EV-AAV处理的细胞中变得明显。这些结果表明，EV-AAV递送可能导致显著的伪转导，且无论采用何种EV纯化方法，都难以与真转导区分开来。
3.2 基于Cre重组酶的双报告系统能够区分伪转导与转导
为应对伪转导的挑战，研究人员开发了一种基于Cre重组酶的新型双报告系统。该系统使用一个Cre响应的AAV基因组，在未重组时持续表达mCherry，而在Cre介导重组后，则切换为表达绿色荧光蛋白（mNeonGreen或eGFP）。这样，在表达Cre的受体细胞中，可以同时可视化生产细胞来源的蛋白/mRNA递送（红色）和真转导（绿色）。他们构建了多种载体变体（改变报告基因、有无核定位序列NLS），并在稳定表达Cre的HEK293FT细胞中测试。结果表明，绿色荧光蛋白仅在含有可转导AAV颗粒的制备物递送至Cre阳性细胞时才被检测到，从而验证了该系统可用于明确指示受体细胞中的真转导。他们选择了带有3xNLS的mNeonGreen载体用于后续实验，因其提供了较高的绿色阳性信号和较低的背景红色信号。进一步的实验表明，受体细胞中观察到的mCherry信号主要来源于生产细胞衍生的mCherry蛋白的递送，而非mRNA递送或未重组AAV基因的表达。因此，研究人员将红色信号所代表的现象（蛋白递送、mRNA递送和/或AAV递送）统称为“混合递送”。
3.3 EV-AAV2表面功能化显著增加HEK293FT细胞的混合递送而非转导
研究人员利用验证后的报告系统，探究了可增强慢病毒或EVs递送的EV功能化策略（如VSV-G、商业产品Ultra-HEK）如何影响EV-AAV的混合递送和转导。VSV-G可结合低密度脂蛋白受体（LDL-R）增强颗粒摄取，并在内体低pH环境下促进膜融合。Ultra-HEK被描述为可增强与HEK293细胞表面蛋白的相互作用以增加摄取，但不介导融合。他们制备了表面展示不同蛋白组合（无修饰、仅VSV-G、仅Ultra-HEK、VSV-G+Ultra-HEK）的EV-AAV2。结果显示，所有功能化策略都增加了对HEK293FT细胞的混合递送，其中VSV-G与Ultra-HEK双重功能化增加最多，这可能是由于受体细胞对颗粒的摄取增加所致。然而，表面功能化并未同比例地增加转导。只有双重功能化策略相比无靶向载体略微增加了对HEK细胞的转导，但没有证据表明VSV-G介导的膜融合增强或阻碍了EV-AAV的转导。
3.4 EV-AAV6表面功能化增加Jurkat T细胞的混合递送和转导
接下来，研究人员探索了EV-AAV对自发性EV摄取率较低的细胞类型——人Jurkat T细胞的递送。他们构建了稳定表达Cre的Jurkat细胞，并选择AAV6血清型，因为AAV6可感染Jurkat细胞。他们重点研究了VSV-G功能化。与HEK293FT细胞中的结果类似，VSV-G功能化增加了对Jurkat细胞的混合递送。但出乎意料的是，与HEK293FT细胞不同，VSV-G功能化也增加了对Jurkat细胞的转导。为剖析VSV-G的何种机制（摄取 vs. 融合）促成了转导增加，他们使用了两种VSV-G突变体：P127D（保留LDL-R结合能力但膜融合缺陷）和K47Q-R354A（阻断LDL-R结合但仍可介导膜融合）。实验表明，野生型（WT）和P127D VSV-G功能化均比K47Q-R354A或无靶向载体导致更多的混合递送和转导。这表明，与Jurkat T细胞上的LDL-R结合是VSV-G增加转导的主要机制。值得注意的是，融合缺陷的P127D VSV-G甚至比WT VSV-G赋予了更多的转导。这些结果可能表明，对于EV-AAV6对Jurkat细胞的递送，增加LDL-R结合可增加颗粒摄取和转导，而膜融合反而限制了转导。
3.5 受者细胞类型而非衣壳血清型决定了功能化对EV-AAV递送的影响
为调和在HEK293FT和Jurkat细胞中观察到的不同模式，研究人员探究了这些差异主要是由受者细胞类型还是AAV血清型驱动的。他们测试了AAV6对HEK293FT细胞的转导，因为AAV6对HEK293FT细胞的感染效率远低于AAV2。他们假设，通过VSV-G功能化增加EV-AAV6的摄取，可能会提高其相对于无靶向EV-AAV6或游离AAV6的转导。实验结果显示，VSV-G功能化如预期那样增加了混合递送，但并未增加EV-AAV6的转导，这与EV-AAV2在HEK293FT细胞中的结果一致。因此，在EV-AAV的转导方面，EV表面功能化策略所赋予的效果呈现出细胞类型依赖性，而非衣壳依赖性。
4 讨论
本研究开发的新分析方法能够明确区分转导与混合递送（包括伪转导），并实现两者的定量。这为理解过去的研究和指导未来的EV-AAV生物工程提供了新的见解。研究观察结果有助于解释EV-AAV文献中一些明显的矛盾。例如，早期研究报道VSV-G假型化降低了EV-AAV2对HEK293细胞的转导，而本研究表明VSV-G既未改善也未阻碍EV-AAV2对HEK细胞的转导，但确实改善了EV-AAV6对Jurkat细胞的转导。总体而言，表面功能化对EV-AAV转导的影响是细胞类型依赖性的。
关于EV-AAV与游离AAV的相对效力，本研究发现游离AAV2在转导HEK293FT细胞方面显著优于无靶向EV-AAV2，而无靶向EV-AAV6在转导HEK293FT细胞方面优于或等同于游离AAV6，EV-AAV6与游离AAV6在转导Jurkat T细胞方面无显著差异。这表明衣壳选择可能影响EV-AAV与游离AAV的相对效力比较，AAV的EV包裹效果具有案例特异性，应在具体应用中进行评估。
本研究聚焦于识别功能性递送的高层次决定因素，同时也为后续机制研究指明了方向。伪转导在积极内吞EVs的HEK293FT细胞中更为明显。增加EV摄取会增加两种细胞类型的伪转导。增加EV-AAV对HEK293FT细胞的摄取（无论是否促进膜融合）会增加混合递送，但并未实质性增加EV-AAV2或EV-AAV6的转导。然而，VSV-G功能化增加了EV-AAV6对Jurkat T细胞的混合递送和转导，且此效应主要由增加的摄取驱动，而非融合；事实上，通过P127D突变阻断VSV-G介导的融合反而增强了转导。这些差异的一个可能解释是，AAV需要在内体中加工（包括衣壳被组织蛋白酶裂解、酸性pH介导的自蛋白水解加工）以暴露有助于病毒体逃离内体并随后进行核运输的磷脂酶域。VSV-G可能改善了EV-AAV6被Jurkat细胞的摄取，克服了一个递送障碍，但VSV-G介导的膜融合可能规避了AAV6衣壳完成转导所需的内体加工。因此，VSV-G P127D突变体平衡了这些效应，从而有益于对T细胞的递送。未来的工作可以探究衣壳加工的每个步骤如何受EV包裹的影响，以及这种加工步骤如何差异性地影响EV表面与EV内部的AAV颗粒。
该研究建立的方法和结论对EV-AAV领域具有重要意义。它提供了一种强大的工具来准确评估工程化EV-AAV载体的效率，避免了伪转导的误导。研究揭示了EV表面工程策略（如增强摄取和融合）对基因递送效果的高度情境依赖性，强调未来设计EV-AAV疗法时必须充分考虑目标细胞类型的内在特性。这些发现为理性设计下一代EV-AAV载体，例如通过衣壳工程或与特定EV修饰策略相结合以优化特定临床应用，奠定了重要的理论基础和方法学框架。
