通过CRISPR/Cas9介导SlVIF基因编辑提升番茄果实甜度的机制研究

《Plant Physiology and Biochemistry》：Enhancing Tomato Fruit Sweetness by CRISPR/Cas9-Mediated SlVIF Gene Editing

为提升番茄果实风味品质，研究人员针对番茄甜度提升难题，通过CRISPR/Cas9技术编辑SlVIF基因，获得了果实蔗糖含量显著降低、果糖和葡萄糖含量显著提高且不改变果实大小和产量的突变体，为番茄高品质育种提供了新资源。

　　

番茄，这种兼具蔬菜与水果双重身份的园艺作物，以其丰富的营养价值深受人们喜爱。然而，在现代商业化育种过程中，育种家们长期将高产和抗病性作为首要目标，却在一定程度上“牺牲”了果实风味的提升。消费者对高品质番茄的需求日益增长，尤其偏爱那些酸甜可口、风味浓郁的果实。一个严峻的现实是，现代栽培的大果番茄品种中，与风味品质密切相关的挥发性香气物质和糖类含量显著降低。更棘手的是，研究证实番茄果实大小与含糖量之间存在显著的负相关关系，即光合产物必须在支持果实膨大和糖分积累之间进行分配，这为在不牺牲果实大小和产量的前提下提升果实甜度带来了巨大挑战。如何运用现代分子设计育种技术，精准地改良番茄品质，成为了一个关键科学问题。

本研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》。为了回答上述问题，研究人员聚焦于调控番茄果实糖分代谢的关键基因——SlVIF。该基因编码的液泡转化酶抑制剂（VIF），是蔗糖（SUC）降解为果糖（FRU）和葡萄糖（GLU）过程中的负调控因子。理论上，敲除SlVIF应能促进FRU和GLU的积累。基于此，研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在番茄育种亲本‘1912’中敲除SlVIF基因，旨在获得果实甜度提升且不改变农艺性状的突变体材料，为高品质番茄育种提供新策略。

研究人员开展此项研究主要应用了以下几个关键技术方法：首先，构建了针对SlVIF基因的双靶点CRISPR/Cas9编辑载体pKSE402-SlVIF，并通过农杆菌介导法转化番茄品种‘1912’的受体材料。通过分子检测（PCR及测序）筛选获得基因编辑突变体。其次，通过自交和分子筛选，获得了不含有外源Cas9元件的纯合突变体株系，用于后续表型分析。最后，研究人员对突变体和野生型（WT）植株的多种性状进行了系统的比较分析，包括农艺性状（植株形态、果实大小、产量）、果实生理指标（可溶性固形物TSS、蔗糖SUC、果糖FRU、葡萄糖GLU、番茄红素、叶绿素含量）、液泡转化酶（VIN）活性、SlVIF基因表达量分析，并利用在线工具预测了VIF蛋白的三维结构变化。

3.1. 获得vif突变体

研究人员成功构建了pKSE402-SlVIF载体并转化番茄，在T₀代中编辑效率高达47%。编辑类型包括杂合、纯合、嵌合和双等位基因突变，其中靶点1的编辑效率（41.16%）高于靶点2（29.4%）。脱靶分析未检测到脱靶事件，表明该编辑系统特异性较高。

3.2. Cas9-free突变体植株的表型变化

从T₀代纯合突变体自交获得的T₁代中，筛选出7个不含有Cas9的纯合突变体（vif-6-3/6/10和vif-16-1/4/7/11）。与WT相比，这些突变体在植株形态、叶片、花朵以及果实形状和大小上均无显著差异，但果实成熟延迟了5-7天。单果重、单株果数和单株产量等产量相关性状也未发生明显变化。

3.3. TSS、SUC、FRU和GLU含量的测定

在果实红熟期（RR），两个突变体群体的可溶性固形物（TSS）含量分别增加了1.17倍和1.19倍。蔗糖（SUC）含量分别显著降低了21.2%和23%，而果糖（FRU）和葡萄糖（GLU）含量则显著升高，vif-6-3/6/10的FRU和GLU分别增加了1.39倍和1.24倍，vif-16-1/4/7/11分别增加了1.39倍和1.26倍。计算得出的果实甜度值比WT高1.33倍。

3.4. 番茄红素和叶绿素含量的检测

与果实成熟延迟的表型一致，突变体果实在各成熟阶段的番茄红素含量均显著低于WT，而叶绿素含量则显著高于WT。

3.5. VINase活性、基因表达及蛋白结构分析

液泡转化酶（VIN）的活性在突变体中显著高于WT。然而，SlVIF基因的转录表达水平在突变体和WT之间无显著差异。蛋白质结构预测显示，vif-6-3/6/10和vif-16-1/4/7/11突变体中VIF蛋白的三维结构因编辑导致肽链大片缺失而发生显著改变，而一个仅缺失两个氨基酸的对照突变体vif-4-3的蛋白结构则与WT相似，其VIN活性和糖含量也未见显著变化。这表明VIF蛋白结构的改变，而非其转录水平的变化，可能是导致VIN活性升高、进而增加糖分积累的原因。

本研究得出结论，通过CRISPR/Cas9介导的SlVIF基因靶向敲除，成功获得了不含有Cas9的纯合番茄突变体vif-6-3/6/10和vif-16-1/4/7/11。与野生型相比，这些突变体在红熟期果实中蔗糖含量显著降低，而果糖和葡萄糖含量以及液泡转化酶活性均显著提高，最终使果实甜度提升了1.33倍，且未影响果实大小和产量。分子机制探究表明，SlVIF基因的转录水平未变，但其编码的VIF蛋白结构因基因编辑发生了显著改变，从而削弱了VIF对VIN酶活性的抑制，最终增强了蔗糖向果糖和葡萄糖的转化。这一发现从蛋白功能层面阐释了甜度提升的机理。

该研究的意义在于，它提供了一种通过精确编辑单一基因（SlVIF）来有效提升番茄果实甜度的新策略，且成功打破了果实大小与糖含量之间的负相关关系，实现了“鱼与熊掌兼得”。所获得的SlVIF编辑突变体不含外源转基因成分，规避了传统RNAi（RNA干扰）等技术可能带来的生物安全性争议，在高品质番茄分子设计育种中展现出广阔的应用前景。这项研究不仅为番茄风味改良提供了珍贵的遗传资源和可行的技术路径，也为其他果蔬作物的品质改良提供了有益的借鉴。