《Antioxidants》：LC-HRMS-Based Metabolomic Profiling and Antioxidant Activity of Sargassum ilicifolium Under Different Pretreatments, Extraction Methods, and Solvents
Anita Dilla Harfiyani,
Riyanti,
Muhammad Nursid,
Till F. Sch?berle,
Maria Alexandra Patras,
Jae-Suk Choi and
Maria Dyah Nur Meinita
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本研究针对刺叶马尾藻(Sargassum ilicifolium)代谢物研究匮乏的现状，采用LC-HRMS代谢组学结合DPPH抗氧化检测，系统评估了预处理、提取方法(浸渍法、微波提取ME)及溶剂极性(n-己烷、乙酸乙酯、甲醇)对506个分子特征及5种注释代谢物的影响。发现甲醇提取物抗氧化抑制率最高(70-100%)，溶剂极性与提取方法是影响代谢谱与活性的关键因素，为海洋生物资源开发提供依据。
在印度尼西亚爪哇岛南岸的日惹特区古农基都尔县，蜿蜒的海岸线孕育着丰富的海洋生物多样性。这里不仅是旅游胜地，更是褐藻家族中一位“低调实力派”——刺叶马尾藻(Sargassum ilicifolium)的家园。马尾藻属作为全球分布最广的大型藻类之一，长期以来被视为潜在的生物活性物质宝库，富含酚类、萜类、岩藻黄素等成分，在抗氧化、抗癌、抗菌等领域展现出诱人前景。然而，现实却有些尴尬：尽管全球马尾藻产量巨大，但其工业应用仍局限于传统的食品与农业，大量资源未被充分利用，甚至被视为海洋废弃物。特别是针对刺叶马尾藻这一广泛分布于印度-太平洋热带海域的物种，其详细的代谢组学图谱及其与抗氧化活性的关联研究几乎是一片空白。现有的研究多集中在其他种类，且缺乏对不同提取策略如何影响代谢物提取效率及生物活性的系统性评估。这种认知的缺失限制了刺叶马尾藻从“海洋杂草”向高附加值功能性食品、化妆品及药物原料的转化。
为了填补这一空白，来自印尼的研究团队Anita Dilla Harfiyani、Riyanti、Muhammad Nursid等联合国际学者，在《Antioxidants》期刊上发表了一项开创性研究。他们选取了古农基都尔县两个环境特征各异的海滩——Nguyahan和Sundak作为采样点，通过精细的实验设计，探究了样品预处理（新鲜vs干燥）、提取方法（传统浸渍法vs微波提取(ME)）以及溶剂极性（非极性n-己烷、中等极性乙酸乙酯、极性甲醇）这三个关键因素如何共同塑造刺叶马尾藻的化学轮廓及其抗氧化潜力。研究结合了先进的液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)代谢组学技术与DPPH自由基清除实验，旨在绘制该物种的首张详细代谢网络图，并揭示影响其抗氧化活性的化学基础，为未来的资源开发利用提供科学指南。
作者为开展此项研究，主要采用了以下关键技术方法：首先，从印尼古农基都尔县的Nguyahan海滩和Sundak海滩采集刺叶马尾藻样本，并进行形态学与DNA条形码双重鉴定，随后分为新鲜和干燥两组预处理。其次，利用浸渍法和微波提取(ME)两种方法，配合n-己烷、乙酸乙酯、甲醇三种不同极性溶剂对样本进行次生代谢产物提取。接着，采用LC-HRMS技术进行代谢组学分析，通过Global Natural Products Social Molecular Networking(GNPS)平台进行分子网络构建与化合物注释。同时，使用DPPH法测定各提取物的抗氧化活性。最后，利用RStudio软件进行统计分析，包括Shapiro-Wilk正态性检验、Levene方差齐性检验、单因素方差分析(ANOVA)及Tukey HSD事后检验，并结合热图和相关性分析探讨代谢物与活性间的关联。
3.1. 代谢组学分析
LC-HRMS分析共检测到506个分子特征（节点），并通过GNPS分子网络聚类。经过数据库比对与人工验证，成功注释出5种主要代谢物，涵盖了萜类（苍术内酯III，Atractylenolide III）、生物碱（脱镁叶绿素A，Pheophorbide A）、聚酮类（1,3,6,8-四羟基-2-(1-羟基己基)蒽-9,10-二酮）以及脂肪酸（13-二十二碳烯酰胺，13-Docosenamide；5-羟基-6E,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酸，5-HEPE）。热图分析显示，大多数注释代谢物主要富集于新鲜样本及微波提取组中。其中，13-二十二碳烯酰胺和脱镁叶绿素A在不同溶剂与方法组合中普遍存在，而苍术内酯III和特定蒽醌衍生物则仅在特定条件下检出。这表明提取参数（尤其是溶剂极性和提取温度）显著影响了代谢物的溶出与回收率。
3.2. 抗氧化活性
DPPH自由基清除实验结果显示，刺叶马尾藻提取物的抗氧化抑制率在30%至100%之间波动。统计分析与可视化数据表明，溶剂极性是影响抗氧化活性的最显著因素（p = 0.034）。具体而言，甲醇提取物表现出最强的自由基清除能力（抑制率约70-100%），显著高于n-己烷提取物（约30-60%），乙酸乙酯提取物则介于两者之间。有趣的是，虽然微波提取在某些代谢物的提取上显示出优势，但在抗氧化活性层面，提取方法（浸渍vs微波）和样品预处理（新鲜vs干燥）并未产生统计学上的显著差异。相关性分析进一步揭示，注释出的代谢物与抗氧化活性呈弱至中度正相关（相关系数r = 0.14-0.27），其中蒽醌衍生物的相关性最高（r = 0.27），暗示抗氧化活性可能源于多种化合物的协同作用，而非单一主导成分。
研究结论与讨论部分指出，本研究首次系统地描绘了印尼海域刺叶马尾藻的LC-HRMS代谢组学特征。研究表明，溶剂极性是决定代谢物组成与抗氧化活性的核心变量，这与极性溶剂更易提取酚类等强抗氧化物质的特性相符。微波提取虽能提高某些代谢物的提取效率，但高温可能导致热不稳定化合物（如氧化脂素）降解，因此在实际应用中需权衡利弊。关于抗氧化机制，研究推测除了已知的苍术内酯III可通过激活Nrf2通路增强内源性抗氧化防御外，脱镁叶绿素A也可能通过调节活性氧(ROS)发挥作用。值得注意的是，新发现的蒽醌类化合物（Averantin）此前未见抗氧化报道，其在此方面的潜力值得深入探究。此外，由于DPPH法主要反映直接清除自由基的能力，未来需结合细胞模型及更多机制研究来全面评估其抗氧化效力。综上所述，该研究不仅证实了刺叶马尾藻作为天然抗氧化剂来源的潜力，更强调了在代谢组学生物活性研究中，依据目标化合物性质精心选择提取策略的重要性，为后续的功能性海洋产物挖掘奠定了坚实基础。
