原位热敏型mRNA负载水凝胶可调节术后肿瘤免疫微环境，从而防止复发和转移

《Biomacromolecules》：In situ thermosensitive mRNA-loaded hydrogel modulates post-surgery tumor immune microenvironment to prevent recurrence and metastasis

本研究开发了一种在位热敏水凝胶平台，协同CRISPR/Cas9基因编辑纳米颗粒和PPS纳米颗粒清除ROS，动态调控巨噬细胞M1/M2比例平衡，有效抑制术后肿瘤复发转移并促进伤口愈合。

　　

刘小青|王长荣|王伟鹏|陈赵旭|罗萌|杨如森|邓洪章

西安电子科技大学生命科学技术学院 & 教育部分子与神经成像工程研究中心，中国陕西省西安市710126

摘要

手术仍然是癌症治疗的主要手段，但术后创伤会通过改变M1型和M2型巨噬细胞之间的关键平衡来破坏局部免疫微环境，同时提高手术部位的活性氧（ROS）水平。术后肿瘤管理中的关键临床难题在于如何在术后微环境中重新平衡巨噬细胞的极化——即保持抑制肿瘤的M1型表型，同时允许必要的伤口愈合M2型功能。在这里，我们开发了一种原位热敏水凝胶平台，能够同时输送两种纳米粒子系统（BC₁₂D NPs和PPS NPs），以缓解免疫抑制微环境。具体而言，将CRISPR/Cas9负载的纳米粒子（BC₁₂D@CRISPR NPs）整合到水凝胶中，以应对切除部位高比例的M2型巨噬细胞，通过有效的M1/M2比例重新编程巨噬细胞，从而发挥强大的抗肿瘤作用。同时，PPS纳米粒子用于清除手术部位的ROS，确保正常的伤口愈合过程不受干扰。利用原位肿瘤切除模型，利用ROS清除和巨噬细胞极化的协同效应，实现了有效的免疫微环境调节。

引言

抗肿瘤M1型巨噬细胞和促肿瘤M2型巨噬细胞之间的动态平衡是多种恶性肿瘤免疫反应效果的关键生物标志物[1]，[2]。临床证据表明，较高的M1/M2比率与肿瘤侵袭性和免疫微环境激活之间存在正相关[3]，[4]，[5]，[6]，[7]。手术仍然是大多数实体瘤的主要治疗手段，但术后复发和转移仍然是主要的临床挑战[8]。目前的辅助策略，包括免疫疗法和化疗，在改善长期治疗结果方面效果有限[9]。这一治疗难题与手术引起的免疫抑制性肿瘤微环境密切相关[10]，[11]。手术引起的组织损伤会引发急性炎症，促使巨噬细胞从初始的M1型表型逐渐极化为M2型表型，这一过程有助于伤口愈合[12]，[13]。然而，这些在切除部位参与伤口愈合的巨噬细胞的行为类似于肿瘤相关巨噬细胞（TAM），后者会促进肿瘤扩散和转移[14]。这种高度可塑性的巨噬细胞可被视为术后肿瘤进展的主要驱动因素[13]。多项研究表明，较高的M1/M2比率与肿瘤良好的预后相关，较高的M1/M2比率与更长的生存期相关[15]，[16]。因此，术后肿瘤学的主要挑战在于在切除部位实现对巨噬细胞极化的时空控制。这需要通过动态表型调控，精确平衡抑制肿瘤的M1型巨噬细胞（以防止复发/转移）和促进愈合的M2型巨噬细胞（以减轻炎症）。

目前，可以通过多种治疗方法将M2型巨噬细胞重新教育为M1型巨噬细胞。例如，应用细胞因子（如IFN-γ和LPS）、小分子抑制剂（如STAT6和PPARγ拮抗剂）、Toll样受体激动剂（特别是TLR4和TLR9配体）以及表观遗传调节剂（HDAC抑制剂）[17]，[18]，[19]。然而，药物递送效率低下和明显的毒性限制了它们的应用[20]，[21]。更严重的是，这些药物诱导的M1型巨噬细胞具有内在的可塑性，容易转变为M2型巨噬细胞，从而导致不良的治疗效果[22]。近年来，随着基因药物和CRISPR介导的基因编辑技术的发展，该技术具有高效性和精确性的优势，被广泛用于肿瘤治疗[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]。值得注意的是，利用CRISPR基因编辑将M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞可以避免M2型巨噬细胞重新极化的问题，从而获得显著的治疗效果。

集落刺激因子1受体（CSF1R）是一种膜相关受体酪氨酸激酶，是集落刺激因子（M-CSF）的受体。M-CSF与其受体CSF1R之间的信号传导对巨噬细胞的趋化性、增殖和M2型极化具有关键调节作用[29]。在乳腺癌和胶质母细胞瘤模型中的临床前研究表明，抑制M-CSF/CSF1R信号传导不仅能够减缓原发肿瘤的进展，还能显著降低转移风险并延长生存期[30]，[31]，[32]，[33]，[34]。然而，针对CSF1R信号传导的单克隆抗体或小分子抑制剂可能会影响巨噬细胞功能，导致过多的巨噬细胞死亡，尤其是抗肿瘤M1型巨噬细胞，进一步促进肿瘤进展[25]。通过CRISPR/Cas9敲低Csf1r以阻断M-CSF/CSF1R信号传导，有望将M2型巨噬细胞重新教育为M1型巨噬细胞并维持这种状态[22]。然而，过多的M1型巨噬细胞可能对术后伤口愈合有害。因此，协调CRISPR/Cas9编辑和ROS清除，以控制一定的M1/M2比率，可以在不影响术后正常伤口愈合过程的同时，改善肿瘤的免疫反应。

在这项研究中，我们开发了一种可注射的热敏水凝胶平台（F127/BC₁₂D/PPS），其中包含CRISPR基因编辑系统（BC₁₂D@CRISPR NPs）和具有清除炎症功能的聚合物纳米粒子（PPS NPs），以抑制肿瘤复发/转移，同时不影响术后伤口愈合。在这里，合成了可电离的碳酸酯脂质（Bn-C₁₂-DMA），并通过微流控技术与DSPC、DMG-PEG₂₀₀₀和胆固醇结合，制备了负载Cas9 mRNA和sgRNA的纳米粒子（BC₁₂D@CRISPR）。同时，PPS用于通过清除手术部位的ROS来减少炎症。F127/BC₁₂D/PPS通过基因编辑和ROS清除能力，在一定范围内调节M1/M2比率。通过调节M1/M2比率，F127/BC₁₂D/PPS能够在黑色素瘤切除模型中有效防止复发和转移，而不妨碍黑色素瘤术后小鼠的生理伤口愈合过程。这种策略可以直接清除残留肿瘤细胞，通过激活免疫细胞形成持久的抗肿瘤免疫记忆，并干扰肿瘤术后的伤口愈合过程。

部分摘录

M1/M2比率对肿瘤复发和伤口愈合的影响

具有不同表型的巨噬细胞在肿瘤免疫治疗和伤口愈合中起着重要作用[35]。为了研究M1/M2比率变化对术后肿瘤复发和伤口愈合的影响，我们分别建立了B16-Luc术后模型和伤口愈合模型。在肿瘤切除模型中，通过体内成像系统（IVIS）确定，约有3.8%的肿瘤细胞残留在手术部位（图S1）。之后，小鼠...

结论

总之，我们成功制备了多功能F127/BC₁₂D/PPS水凝胶系统，其中包含负载CRISPR/Cas9系统的BC₁₂D NPs和具有ROS清除能力的PPS NPs。这种联合策略在第七天能够有效调节巨噬细胞的M1/M2比率至约1.30，在第十四天调节至约1.83，这对管理术后肿瘤复发/转移和伤口愈合起到了关键作用。

Bn-C₁₂-DMA的合成

在三甲基氧丙烷中溶解乙酮，在氩气氛围下，然后向溶液中部分加入N,N'-羰基二咪唑，在室温下搅拌1小时，期间溶液应变得清澈。静置1小时后，通过过滤获得粗产物，并用冰醚洗涤三次，然后在真空下干燥，得到最终的白色固体产物MTP。随后，将MTP溶解在乙酮中，并加入...

CRediT作者贡献声明

王伟鹏：方法学，数据管理。罗萌：项目管理，正式分析。陈赵旭：方法学，正式分析。邓洪章：写作 - 审稿与编辑，写作 - 初稿，监督，项目管理，资金获取，正式分析，数据管理。杨如森：写作 - 初稿，监督，资金获取，数据管理。王长荣：写作 - 审稿与编辑，写作 - 初稿，监督，调查，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFA1212500）、重大科技创新项目 - 重大科技成果转化项目（“教育、科技和人才”一体化项目）（L2025-ZDKJ-ZDCGZH-015）以及陕西省自然科学基金（2025JC-QYCX-066）的支持。