《International Journal of Biological Macromolecules》：Guar gum macromolecule-based nanoformulation of syringic acid for enhanced diabetic wound healing: Box–Behnken optimization and in vitro evaluation
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糖尿病伤口愈合受氧化应激、血管生成不足和再生延迟影响。本研究通过Box-Behnken设计优化了含柳杉酚的吉利丁纳米制剂（NF），粒径约26 nm，包封率83%，具有负电性及球形形态。NF在糖尿病样条件下显著降低脂质过氧化，提升超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性，促进角质形成细胞迁移（81.6%创面闭合）和内皮管形成（71.61% VEGF阳性细胞）。纳米封装增强了柳杉酚的稳定性、缓释特性及细胞相容性，为糖尿病创面治疗提供新策略。
作者：Debojyoti Mandal、Kriti Kushwaha、Jayanta K. Sarmah、Jeena Gupta、Vancha Harish
印度旁遮普邦贾兰达尔市Lovely Professional University（LPU）生物工程与生物科学学院植物学系，地址：Delhi G.T. Road, Phagwara, 144411
摘要
糖尿病患者的伤口愈合受到持续氧化应激、血管生成减少和组织再生延迟的影响。本研究采用Box–Behnken设计开发并优化了一种基于瓜尔胶的丁香酸纳米制剂（NF），以改善其物理化学性质和体外生物性能。优化后的NF平均粒径约为26纳米，多分散性（PDI）低（约0.1），ζ电位为负值（-27.6 mV），包封效率高（约83%），且呈球形。热分析和光谱分析证实了药物的成功结合及稳定性的提高。体外释放实验表明该制剂具有缓释特性。与游离丁香酸相比，NF表现出更强的抗氧化活性，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用更强，并且在L929成纤维细胞和HaCaT角质形成细胞中具有更好的细胞相容性。在高血糖条件下，NF显著降低了脂质过氧化，并恢复了内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽S-转移酶GST）的活性。此外，该制剂还能促进角质形成细胞迁移（伤口闭合率81.6%）和内皮管形成（VEGF阳性细胞比例增加71.61%）。总体而言，纳米包封技术提升了丁香酸在糖尿病模拟条件下的功能活性。这些发现为未来的体外机制研究和体内实验奠定了基础。
引言
糖尿病是一种进行性代谢紊乱，其特征是长期高血糖，是全球主要的健康挑战，影响着数亿人[1]。伤口愈合障碍是其最严重的并发症之一，常导致慢性不愈合伤口和严重感染的风险增加。全球约有20-33%的糖尿病患者在其一生中会发展成糖尿病足溃疡（DFU），其中一年内的复发率约为40%，五年内的复发率高达65%[2]。随着糖尿病患病率的持续上升，对有效且多功能伤口愈合策略的需求变得日益迫切[3]。
近期伤口愈合研究主要集中在生物活性肽和蛋白质基治疗剂上，因为它们具有特定的生物信号传导能力和再生潜力。然而，这些生物分子通常存在稳定性低、易被酶降解、生产成本高以及储存要求严格等局限性[4],[5],[6],[7]。相比之下，基于纳米技术的递送系统具有优势，如提高的物理化学稳定性、保护不稳定的生物活性化合物、可控的缓释特性以及更灵活的制剂设计[8]。特别是基于多糖的纳米制剂，具备生物相容性、易于化学修饰和可扩展的生产方法[8]。因此，纳米技术可以为改善生物活性化合物在伤口相关应用中的功能性能提供补充或替代方案。
瓜尔胶是一种天然且可生物降解的多糖，作为药物递送载体具有显著优势，因为它具有良好的生物相容性、黏附性以及形成稳定纳米结构的能力[9],[10],[11]。丁香酸（SRN）是一种通过莽草酸途径合成的植物来源的酚类化合物，具有已证实的抗氧化[12]、抗炎[13]和抗菌[14]作用。此外，由于其强大的自由基清除能力和对多种细胞途径的调节作用，SRN在代谢、心血管、肿瘤和神经疾病治疗中也显示出潜力[15],[16]。然而，游离形式的SRN容易降解，局部生物利用度有限，从而限制了其临床应用。
将这两种成分结合到单一纳米系统中，可以充分利用瓜尔胶的结构优势以及SRN的多种生物活性。基于瓜尔胶的纳米制剂可以保护SRN免受过早降解，增强其在目标部位的滞留，并提供有利于细胞附着和组织重塑的水合微环境。同时，SRN有助于减轻氧化应激和炎症反应，调节促血管生成信号通路[16]。
尽管已经对多糖基纳米载体和酚类抗氧化剂进行了广泛研究，但在糖尿病模拟条件下对基于瓜尔胶的丁香酸纳米制剂进行系统统计优化的研究尚不全面。此外，将响应面方法与多级生物评估（包括抗氧化活性、抗糖尿病酶抑制、角质形成细胞迁移和高血糖下的血管生成反应）相结合的研究仍然有限。因此，一种合理优化的纳米制剂将制剂设计变量与功能性生物结果联系起来，有助于深入理解结构-活性关系并提升体外性能。本研究旨在设计、优化并全面评估一种载有丁香酸的瓜尔胶纳米制剂（NF），重点考察其在高血糖条件下的物理化学性质、抗氧化和抗糖尿病活性、细胞相容性、角质形成细胞迁移及血管生成反应。采用广泛用于药物优化的Box–Behnken设计（BBD）系统研究了制剂变量及其相互作用，从而开发出一种稳定的优化纳米制剂[17]。总体而言，本研究提供了一种在高血糖条件下具有增强体外功能的瓜尔胶纳米制剂，为未来的机制研究和体内实验奠定了基础。
材料
甲醛（25%）和HPLC级二氯甲烷（DCM）购自印度孟买的Merck Chemicals公司。甘油、HPLC级水和Span80购自印度孟买的HI Media Laboratories公司。超高纯度瓜尔胶粉末（110 kDa）购自SRL公司。丁香酸（CAS号：530–57-4，分子量：198.17）购自Sigma Aldrich公司。
通过改性的油包水（o/w）原位聚合交联方法制备纳米制剂
采用改性的油包水乳化及原位交联方法制备纳米制剂[9]。首先将Transcutol? P和 Tween 80/Tween 20（体积比2–5%）的混合物溶解在含有药物的10 mL DCM中（药物与聚合物的比例为1:6），然后缓慢注入30 mL的水溶性瓜尔胶溶液中并持续搅拌。达到饱和后，以40%的振幅进行超声处理8–20分钟（每30秒工作10秒休息）。
NF的优化
根据Box–Behnken设计，分别对所有17个实验进行了单独配方设计和表征，以研究交联剂、超声处理时间和乳化剂含量等因素对粒径、多分散性（PDI）、ζ电位（ZP）和包封效率（EE%）的影响（公式（9）、（10）、（11）、（12））。实验结果发现：粒径范围为19.2纳米（实验14）– 41.7纳米（实验11），多分散性范围为0.149（实验8）– 0.562（实验10），ζ电位范围为-24.1 mV（实验17）– -31.2 mV（实验9），包封效率范围为67.69%（实验4）– 93.95%（实验9）[表1，补充表1]。
讨论
通过Box–Behnken设计系统优化了纳米制剂，以确定制剂变量与关键质量属性之间的关系。超声处理时间（因素B）通过空化作用破坏液滴，从而协同降低了粒径[40]。相反，较高的交联剂浓度（因素A）和乳化剂比例（因素C）由于增加了粘度和界面拥挤效应，反而产生了相反的影响。
结论
本研究表明，瓜尔胶纳米包封显著提高了丁香酸在高血糖条件下的体外稳定性和生物活性。优化后的纳米制剂具有纳米级粒径、缓释特性和更好的细胞相容性。重要的是，该制剂能够调节氧化应激相关指标，并支持体外伤口愈合过程中的细胞活动，包括角质形成细胞迁移和内皮细胞功能。
作者贡献声明
Debojyoti Mandal：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Kriti Kushwaha：撰写 – 审稿与编辑、方法设计。Jayanta K. Sarmah：撰写 – 审稿与编辑、结果验证、项目监督、概念构建。Jeena Gupta：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、实验设计。Vancha Harish：初稿撰写、方法设计、实验设计。伦理审批
不适用。关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本手稿期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）帮助起草和修改部分文本以提高清晰度和语言表达。使用该工具后，他们仔细审查并编辑了内容，对发表作品的准确性、完整性和原创性负全责。
资金支持
不适用。利益冲突声明
作者不存在需要声明的利益冲突。
致谢
作者感谢LPU中央仪器设施在研究过程中提供的支持。同时感谢使用ChatGPT帮助修正或起草部分文本。
