原型 timsOmni 平台可利用低能与高能电子基碎裂技术实现 IgG 免疫球蛋白关键高变 CDR3 区域的高可信度注释

《Analytical Chemistry》：A Prototype timsOmni Platform Enables Confident Annotation of the Key Hypervariable CDR3 Regions of IgG Immunoglobulins Using Low- and High-Energy Electron-Based Fragmentation

　　

本文介绍了首台原型 timsOmni 仪器的构型，该仪器将 Omnitrap 线性离子阱集成至 timsTOF 平台之中。研究描述了一种用于 Omnitrap 中电子基碎裂（ExD）模块的改良电极设计，从而同时提升了系统稳健性与性能。抗体的最佳表征不仅需要对轻链和重链进行成对分析，还需要对其可变结构域进行测序并鉴定任何修饰。采用蛋白质中心型蛋白质组学（protein-centric proteomics）最适合解决这一问题，因为该策略能够保留异质性信息，例如每个已鉴定片段的特定克隆来源。此外，当作用对象为保留部分结构的完整蛋白质时，例如仍保留二硫键的蛋白质，则可将碎裂定向至关键区域，例如对每个克隆均具有唯一性且为靶标识别所必需的高变互补决定区（CDR3）。因此，作为概念验证，研究人员使用原型 timsOmni 质谱仪开展抗体分析。仅使用电子基碎裂方法，即获得了成对重链与轻链的完整 CDR3 序列。最佳结果通过对类天然构象的抗原结合片段（Fab）前体离子在约 35 eV 电子能量下实施电子诱导解离（EID）获得。该方法同时产生（a, x）与（c, z）成对碎片离子，从而有望提高序列覆盖度与注释置信度。总体而言，本文所展示的 timsOmni 质谱仪可作为蛋白质中心型蛋白质组学的先进且多功能平台。

本文发表于《Analytical Chemistry》，核心内容是围绕一种新型原型 timsOmni 质谱平台的构建与验证，评估其在抗体蛋白质中心型测序中的应用能力，尤其是针对 IgG 免疫球蛋白高变互补决定区 3（CDR3）的高可信度注释。抗体已成为现代生物治疗药物的重要类别，尤其单克隆抗体（mAb）广泛用于肿瘤和自身免疫性疾病治疗，因此其结构表征与质量控制具有重要意义。然而，IgG₁ 抗体由两条重链（Hc）和两条轻链（Lc）组成，结构复杂，且不同克隆之间虽然整体序列相似度较高，但真正决定抗原特异性的区域集中于N端高变区，尤其是每条链上的 CDR1、CDR2 和 CDR3。其中，CDR3 被认为是抗体特异性识别的关键决定区域。因此，如何在保留轻链/重链配对信息的前提下，对抗体高变区进行可靠测序，是当前抗体质谱分析中的关键挑战。

传统自下而上（bottom-up）肽段中心策略虽然广泛用于抗体测序、质量控制和多属性监测（MAM），但往往会丢失肽段的克隆来源以及轻重链配对关系，不利于解析抗体真正具有功能意义的高变区信息。相比之下，蛋白质中心型（protein-centric）策略可在完整蛋白或大分子片段水平上保留更丰富的结构与异质性信息，适合用于抗体可变区分析。研究人员此前已持续开展内源性抗体抗原结合区的分析工作，本研究则进一步借助原型 timsOmni 平台，探索低能电子捕获解离（ECD）与高能电子诱导解离（EID）对抗体 Fab 片段的碎裂行为，目标是实现 CDR3 区域的明确注释，并尽可能获得多个互补碎片序列读段以提高从头测序置信度。

在技术方法方面，研究人员选用两种重组单克隆 IgG₁ 抗体 trastuzumab 和 7D8，经 IgdE 铰链切割蛋白酶消化获得 Fab 片段，并分别在变性与天然条件下通过纳升电喷雾电离（nESI）进入原型 timsOmni 质谱平台分析。仪器基于 timsTOF Ultra，并整合 Omnitrap 线性离子阱，通过改良 Q5 区实现电子基碎裂（ExD），分别开展 ECD 和 EID 实验。数据经 Bruker OmniScape 进行已知序列确认式碎片注释，并结合人工核查完成结果分析。

研究结果首先在“timsOmni Prototype Instrument Design and Description”部分中展示了该平台的硬件构型与 Q5 模块改进。研究人员指出，该平台是在 timsTOF Ultra 基础上深度改造，并整合最新 Omnitrap 技术构建而成，可兼容捕获模式下的 ExD、CID 及高效串联 MSⁿ 工作流程，也可在传输模式下保留 timsTOF 平台原有的 DIA 与 PASEF 能力。新设计的 Q5 区引入外部电子源，采用氧化钇包覆铱阴极产生电子束，并通过透镜系统耦合进入离子阱，实现 0–150 eV 范围内精细可控的电子能量调节。与既往设计相比，Q5 出入口槽口几何形状经过重新优化，显著改善了电子传输效率、耐用性和反应速度，同时抑制了杂散高能电子对离子的非理想作用，使低能 ECD 条件下主要获得（c, z）离子对，为高质量电子基碎裂提供了硬件基础。

在“Assessing the Performance of the Prototype timsOmni Platform for Protein-Centric Characterization of Antibodies”部分，研究人员围绕 timsOmni 在抗体蛋白质中心型测序中的性能进行了验证。研究重点考察了不同电子能量以及变性/天然电离状态下 Fab 前体离子的碎裂差异。结果表明，ECD 的最佳电子动能约为 0 eV，而 EID 的最佳电子动能约为 35 eV。前者主要通过电子捕获形成电荷降低自由基前体，后者则通过高能电子诱导形成电荷升高的 meta-ionized 物种。对于原生态 Fab 离子，这两种过程均可通过前体电荷态变化清晰监测，从而建立电子能量依赖曲线并确定最佳实验条件。

在“ExD Affords Critical Insights into the Lc/Fd Pairing and Sequences of Fab Molecules”部分，研究人员比较了 ExD 对变性和天然 Fab 的序列信息贡献。对变性条件下的高电荷 Fab 前体，ECD 与 EID 均可触发链间二硫键气相还原，从而释放轻链（Lc）与重链 Fd 片段，且可在多个电荷态下高精度识别。这一点对于抗体 Lc/Fd 配对判定具有重要价值。序列层面上，变性条件下 ExD 可有效覆盖两条链中链内二硫键之间的区域，即包含 CDR3 的关键区段。ECD 可通过 c 型离子读段实现 Lc-CDR3 90% 和 Hc-CDR3 88% 的覆盖，而 EID 则进一步提供相关联的 a 型离子序列，使 Lc-CDR3 覆盖达到 100%，Hc-CDR3 为 75%。不过，CDR1 与 CDR2 因处于链内二硫键闭环结构中，在 MS² 层面无法直接覆盖。

对天然条件下的低电荷 Fab 前体，ExD 同样能优异覆盖链内二硫键之间的区域。ECD 已可提供 a、c、z 多种离子系列，实现 Lc-CDR3 100%、Hc-CDR3 88% 的覆盖；EID 则表现更佳，不仅维持相同覆盖度，还能同时获得 a、c、x、z 四组完整序列系列，偶见少量 b 和 y 离子，从而显著增强 CDR3 注释的明确性和可靠性。研究还观察到，天然条件下轻链来源碎片强度略高于 Fd 来源碎片，因此重链 C 端互补离子系列存在少量缺口。

在“Improved separation across the m/z range results in more interpretable data when Fabs are analyzed under native MS conditions”相关结果中，研究人员进一步解释了为什么天然条件下的分析更有利于高可信度注释。变性条件下，由于 Fab 带电高，几乎所有碎片离子集中在 1000–2000 Th 范围，与电子反应后的自由基前体严重重叠，同时同一断裂位点可对应多个不同电荷态碎片，导致谱图拥挤、注释困难。相比之下，天然条件下低电荷 Fab 经 ExD 后，碎片分布扩展至 1000–5000 Th 范围，N 端与保留对应链的 C 端互补碎片群在 m/z 维度上明显分离，并与前体及其自由基离子分开，既提高了同位素分辨效果，也减少了无关离子的干扰，因此大幅改善了谱图可解释性和注释准确度。

在“ExD Provides High-Confidence CDR3 Annotations across the Region Encompassing CDR3”部分，研究人员进一步采用注释碎片置信度评分和氨基酸残基置信度评分，系统比较不同条件下 CDR3 区域的注释质量。结果显示，若仅比较单个碎片注释质量，ECD 在变性和天然条件下均可产生更高评分的 c 型离子；但若综合考虑覆盖范围、N 端多种离子系列的高置信度注释，以及互补 C 端离子的存在，则 35 eV EID 作用于类天然低电荷 Fab 前体时表现最佳。该条件下获得了最完整、最可靠的免疫球蛋白高变 CDR3 区域序列信息，是本研究的核心结论。

讨论与结论部分指出，本研究建立并验证了一种集成最新 Omnitrap 技术的原型 timsOmni 质谱平台，改进后的 Q5 模块提升了电子束电流承载能力、稳定性和 ExD 反应效率，可快速获得高质量 ECD 和 EID 谱图。以 IgG₁ Fab 为模型的概念验证表明，针对 CDR3 区域，最佳测序效果来自类天然低电荷 Fab 的 35 eV EID，原因在于该策略可减少谱图拥挤并产生多个相关联的序列读段，从而提升覆盖度与注释置信度。相比之下，ECD 则更有助于获得 Lc/Fd 配对信息，并产生更高质量的部分 c 离子读段，尤其适用于变性条件下获得的 Fab。鉴于反相液相色谱-质谱（LC-MS）通常生成变性 Fab，研究人员认为 ECD 更适配此类在线工作流程，并可用于轻链/重链配对判定。研究还指出，重复断裂位点产生的多电荷态相关碎片虽增加谱图复杂度，但也为从头测序算法提供了降低假阳性、增强序列标签可靠性的有利特征。对于受链内二硫键限制而难以直接解析的 CDR1 和 CDR2，未来可通过 ExD 后补充碰撞活化或更高阶 MSⁿ 工作流程加以拓展。结论部分可译为：本文描述了一种原型 timsOmni 质谱平台，其将最新一代 Omnitrap 技术完整集成至成熟的 timsTOF Ultra 平台中。研究评估了 Omnitrap 中经改进的、专用于 ExD 的 Q5 区性能，该设计具有更高耐久性并可承受更高电子电流，从而较原始构型实现更快速的电子基活化并获得高质量 ECD 与 EID 谱图。在本项概念验证研究中，研究人员利用该仪器对 IgG₁ Fab 片段进行测序，并比较了变性与天然条件下、高低电荷态 Fab 分子在低能 ECD 与高能 EID 中的碎裂行为。聚焦 Fab 的 CDR3 区域时，研究证实，采用 EID 作用于类天然低电荷 Fab 前体可获得最佳覆盖度和最高注释置信度；而 ECD 则额外提供有助于链配对分析的高强度 Lc/Fd 片段离子以及略更多高置信度 c 离子读段。总体上，该研究证明 timsOmni 是一个适用于蛋白质中心型抗体分析的先进多功能平台，并为后续开发更高阶 MSⁿ、结合离子淌度的多模式生物大分子分析流程奠定了基础。