固定化酶反应器与超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-QTOF-MS）结合，用于从乌头（Aconitum carmichaelii）的地上部分中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂候选化合物

《Journal of Chromatography B》：Immobilized enzyme reactor coupled with UHPLC-QTOF-MS for screening acetylcholinesterase inhibitory leads from Aconitum carmichaelii aerial parts

基于磁性固定化酶反应器与UHPLC-QTOF-MS联用技术，成功从颠茄wei root废弃物AAL中筛选出五种结构多样的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性成分，揭示了其未被充分挖掘的药用潜力，同时验证了可持续的农业废弃物资源化新策略。

　　

梅丹玲|苏浩杰|赵艳艳|张晓丹|姜彩英|赵学琴

浙江科技大学生命科学与医学院，中国杭州310018

摘要

Aconitum carmichaelii Debx.（AAL）的地上部分是一种丰富的农业副产品，但通常被丢弃，它们可能是乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂的一个未被探索的来源。然而，从如此复杂的基质中直接筛选生物活性化合物面临重大的分析挑战。在这里，我们报告了一个集成平台，该平台结合了磁性固定化酶反应器和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS），用于有效筛选AChE抑制剂。AChE被固定在磁性壳聚糖微球（AChE@MCM）上，创建了一个可重复使用且稳定的生物反应器，活性回收率达到了80.9%，并且可以重复使用超过8次，同时具有更好的pH稳定性。当应用于AAL提取物时，这种策略有效地筛选出了五种具有不同结构的潜在AChE抑制剂，直接揭示了这种废弃资源的未开发药用潜力。我们的工作不仅提供了一种可持续的方法来利用农业副产品，还验证了一种在复杂天然产物中进行快速生物活性导向筛选的强大工具。

引言

< />Aconitum Carmichaelii Debx.（Aconitum Carmichaelii的侧根）表现出广泛的药理活性，包括镇痛、抗炎和抗痴呆作用。其抗DA活性也有报道，某些化学成分（如肉豆蔻酸、deltoin等）已被证明与AD相关过程有关[7]、[8]。虽然Aconitum的根部已被广泛研究，但其地上部分尽管含有丰富的生物碱且可持续获取，但仍未得到充分探索。Aconitum carmichaelii Debx.的地上部分通常作为农业废弃物被丢弃。然而，我们之前的研究表明，Aconitum carmichaelii Debx.的地上部分提取物对乙酰胆碱酯酶（AChE）具有抑制活性[9]。然而，从天然产物中筛选生物活性成分由于复杂植物提取物中的基质效应而面临重大挑战。解决这些限制不仅为药物发现扩展了资源基础，也有助于更全面和可持续地利用Aconitum资源。

目前用于识别活性化合物的方法，如薄层色谱（TLC）-生物自显影和亲和超滤，需要迭代分离步骤，通量较低，并且难以区分复杂植物提取物中具有相似滞留因子（Rf）的化合物，而亲和质谱技术虽然具有更高的特异性，但成本高昂、不可重复使用且依赖昂贵的仪器[10]。此外，植物化学成分（如多酚、生物碱、色素）常常干扰光谱检测方法，导致活性测定出现假阳性或假阴性结果。为了解决这些挑战，基于固定化酶的筛选方法作为一种变革性策略出现，因为它具有分离简便、减少基质干扰、稳定性好以及可重复使用等优点[11]。对于酶的固定化，合适的支撑材料和固定化方法对于提高固定化酶的活性至关重要。在各种类型的固体载体中，壳聚糖作为一种天然柔性生物聚合物，由于其无毒、低成本、高反应性、可生物降解性和热稳定性，被用作理想的固定化酶支撑材料。此外，其生物相容性和柔韧性有利于保持酶的构象，从而保留酶的活性[12]。例如，Shi Xiao-Ya等人[13]使用经过聚乙烯亚胺处理的钙藻酸盐-壳聚糖凝胶固定化酵母α-葡萄糖苷酶，并用它来筛选12种传统中药中的酶抑制剂。然而，有限的尺寸和非磁性支撑材料阻碍了高效分离和在连续过程中的快速重复使用，从而导致更复杂的程序和大量的酶浪费。磁性微球可以通过外部磁场实现固定化酶的快速分离，从而解决这个问题[14]。基于壳聚糖的磁性微球作为酶支撑材料的有效性已经得到充分证实。它们的表面官能团（如-NH?和-OH）有助于共价固定，而Schiff碱基可以与过渡金属阳离子配位，有助于纳米粒子的稳定和酶稳定性的提高[15]。此外，壳聚糖的官能团还提供了通过螯合作用吸收金属离子的独特机会，从而可以制备各种金属（氧化物）纳米粒子[16]。然而，尽管有这些基础，将这些壳聚糖磁性微球开发成稳定的、可重复使用的生物反应器，以直接从高度复杂的废弃非传统药用部分提取物中“捕获”未知生物活性配体，仍然是一个显著未探索的研究领域。

在这里，我们开发并验证了一个简化的AChE@MCM-UHPLC/QTOF-MS工作流程，用于快速筛选Aconitum carmichaelii Debx.废弃地上部分中的AChE抑制剂。这个集成平台通过结合目标特异性配体捕获、高效磁性分离和高分辨率鉴定，克服了传统方法的局限性，将这三个步骤整合到一个高效的过程中。在系统优化固定化条件后，所得到的AChE@MCM反应器被用来直接从粗AAL提取物中捕获潜在抑制剂，捕获的配体通过UHPLC-QTOF-MS得到明确鉴定。通过这种靶向方法鉴定出的化合物作为有价值的（i）化学探针，用于研究胆碱能功能，以及（ii）等待进一步神经生物学评估以评估其治疗潜力的候选先导化合物。

材料

AChE（C3389–500 UN，来自电鳗）从Sigma（美国）购买。壳聚糖（脱乙酰度95%）、戊二醛（GA，50%）和吲哚-3-乙酸从Maclean Biochemical Technology Co.（上海，中国）获得。六水合氯化铁（FeCl₃·6H2O）、醋酸铵（NH₄Ac）、huperzine A、5,5′-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、乙酰硫代胆碱碘化物（ATCh）和甘氨酸从Aladdin（上海，中国）购买。此外，还购买了无水乙醇、石油醚、乙基

AChE固定化磁性反应器的表征

氨基磁性复合材料由于出色的磁响应性和较大的负载能力，已被用于活性分子的固相分离。在这项工作中，通过CS辅助的水热方法制备了含有丰富反应性氨基的混合Fe₃O₄/CS微球（MCM）。MCM的形态和分散性通过SEM检测。如图1a所示，MCM的粒径约为322.20?±?32.31?nm，粒径分布（PDI）为0.010。

讨论

植物来源的AChEIs由于结构多样性、多靶点效应和良好的安全性而成为抗AD药物开发的关键资源。其中，huperzine A作为一种可逆抑制剂，具有高选择性、优异的血脑屏障渗透性和较长的作用持续时间而脱颖而出。基于生物碱的抑制剂（例如来自Physostigma venenosum的physostigmine和来自Galanthus属的苯并呋喃啶生物碱）能够竞争性地结合到催化位点

结论

本研究通过将磁性固定化酶反应器与UHPLC-QTOF-MS结合，成功建立了一个多功能分析平台，实现了从复杂植物提取物中快速高效地筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。该策略不仅从之前被丢弃的Aconitum carmichaelii Debx.地上部分中鉴定出五种潜在抑制剂，揭示了其未开发的药用价值，还验证了一种可重复使用且稳定的

CRediT作者贡献声明

梅丹玲：撰写——原始草稿、方法学、形式分析。苏浩杰：撰写——原始草稿、方法学、形式分析。赵艳艳：方法学、形式分析。张晓丹：资源、方法学。姜彩英：撰写——审稿与编辑、监督。赵学琴：资源、方法学。

资助

本工作得到了中国大学生创新与创业训练计划（202410338044、202510338052、S202510338055）和浙江科技大学（24042127-Y）的基础研究基金的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢中国大学生创新与创业训练计划的基础研究基金和浙江科技大学的基础研究基金对这项研究的支持。