巴基斯坦红茶中的黄酮二聚体：酶促氧化合成、结构解析、检测方法及其对乙酰胆碱酯酶的抑制机制

《Journal of Molecular Structure》：Flavone Dimers in Pakistani Black Tea: Enzymatic Oxidative Synthesis, Structural Elucidation, Detection, and Acetylcholinesterase Inhibitory Mechanisms

本研究通过酶促氧化偶联法合成黄烷醇-黄烷醇和黄烷醇-芦丁二聚体，利用HRMS/NMR确认结构，并发现二者对AChE有纳米摩尔级抑制活性，作用机制涉及疏水作用、氢键及π-π堆积，且证实其天然存在于巴基斯坦红茶中，为开发神经保护剂提供新策略。

　　

穆夫扎拉（Mufzala）|李思瑞（Si-Rui Li）|宋娜（Na Song）|李佳怡（Jia-Yi Li）|杨子（Zi Yang）|张鹏（Peng Zhang）|张大伟（Da-Wei Zhang）|赛义德·阿希克·侯赛因（Syed Ashiq Hussain）|玛丽亚姆·法蒂玛（Mariam Fatima）|鲍冠华（Guan-Hu Bao）

中国安徽省合肥市安徽农业大学茶叶化学与健康效应国际联合实验室，国家茶叶种质创新与资源利用重点实验室，天然产物实验室，邮编230036

摘要

黄酮类化合物来源于植物，具有抗氧化和抗衰老特性，其二聚体形式作为生物活性分子出现，具有更好的稳定性和新的治疗作用。本文报道了通过一种新型酶促氧化偶联方法合成并表征了两种黄酮二聚体——木犀草素-木犀草素（luteolin-luteolin）和木犀草素-芹菜素（luteolin-apigenin），并使用高分辨率质谱（HRMS/MS）和一维/二维核磁共振（1D/2D NMR）光谱验证了它们的分子结构。多模式结合测定、分子对接、荧光猝灭和紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）显示，这些黄酮二聚体与乙酰胆碱酯酶（AChE）之间存在强纳米摩尔级的相互作用，这种相互作用由疏水作用、氢键和π–π堆积驱动。热力学分析表明其结合模式稳定且具有特异性。高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-HRMS/MS）分析证实这两种二聚体是巴基斯坦红茶中的天然成分，这将其强大的生物活性与饮食来源联系起来。总体而言，这些研究结果确立了这两种结构明确的黄酮二聚体作为有效的AChE抑制剂的作用，为开发神经保护剂提供了新的合成框架。

引言

茶叶是最受欢迎的芳香饮料之一，来源于Camellia sinensis的叶子，以其药用特性而闻名[1]。茶叶最初发现于中国西南部，如今在全球60多个国家都有种植[2]。在巴基斯坦，茶叶主要在开伯尔-普赫图赫瓦省的Shinkiari地区种植，该地区具有特殊的气候条件，茶叶具有独特的化学特性[3]。茶叶生长在pH值为4.5–5的沙壤土中，海拔高度为1000–1500米。该地区夏季气温在20–40°C之间，冬季气温在-4–20°C之间[4]。凉爽的夜晚、温暖的白昼和降雨等气候因素直接影响茶叶的成分和质量[5]。尽管茶叶具有重要的工业价值，但其化学性质和生物活性却鲜有研究[5]。 红茶经过酶促发酵，赋予其独特的香气、风味和治疗特性[6]。这一复杂的生化过程称为氧化聚合，主要由多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）催化[7]。黄酮类化合物的这种酶促氧化聚合导致形成高分子量的化合物，如茶红素和茶褐素[8,9]。芹菜素和木犀草素（图1）是茶叶中的重要单体黄酮，在茶叶加工过程中会发生发酵[10]，因此可以合成二聚体复合物。然而，由于这些化合物在自然界中的含量较少且茶叶基质结构复杂，直接从茶叶中鉴定和分离它们具有挑战性。 在POD或漆酶（laccase）存在下进行的合成酶辅助氧化可以模拟茶叶加工中的发酵反应[11,12]。这种方法可以制备结构明确的化合物，有助于分析它们在天然茶叶提取物中的存在及其药用特性[13]。在受控的体内条件下使用的酶可以减少复杂茶叶基质带来的干扰，从而通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）等分析技术纯化茶叶化合物并简化其结构鉴定[11,14]。 氧化偶联的黄酮类化合物可能与单体相比具有不同的生物功能。它们与酶（如AChE）的相互作用参与胆碱能神经传导[15]，这一点尤其值得关注。AChE在突触间隙中水解乙酰胆碱，其失调可能导致阿尔茨海默病等神经退行性疾病[16]。因此，来自食物的天然化合物（如黄酮类）可能是更安全的AChE抑制剂的有效替代品[17]。许多单体黄酮（如槲皮素、木犀草素和芹菜素）可作为抑制剂，因为它们可以通过疏水接触、氢键和π–π堆积与AChE相互作用[18]。然而，尽管聚合物黄酮的结合表面积可能更大，但在这一领域对其的研究还不够广泛。 本文通过POD介导的氧化偶联合成了木犀草素-木犀草素和木犀草素-芹菜素二聚体，模拟了红茶加工的发酵条件。使用HPLC-ESI-HRMS和详细的1D/2D NMR分析阐明了它们的结构，并通过与合成标准的保留时间和质谱特征比较，验证了它们在巴基斯坦红茶提取物中的存在。我们还研究了这些黄酮二聚体对AChE的抑制作用，并通过分子对接、荧光猝灭和紫外-可见光谱解释了它们的结合过程和热力学效应。这项研究通过仿生合成、现代结构表征、与酶的多层次相互作用分析以及作为天然AChE抑制剂的可能性，揭示了茶叶发酵过程中黄酮的变化。

化学品

木犀草素和芹菜素标准品（纯度≥98%）购自中国陕西的宝济Herbest Bio-Tech有限公司。纯净水（H₂O）由杭州哈哈集团有限公司提供。HPLC级溶剂甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）购自安徽Tedia高纯度溶剂有限公司。LC-MS级甲酸和乙腈购自美国新泽西的Fisher Chemical公司。石油醚（PE）、乙酸乙酯（EtOAc）和甲醇（MeOH）也用于实验。

黄酮二聚体的合成

化合物1被鉴定为两个木犀草素单元通过分子间的C2′–C6″键连接而成的同聚体，而2是一种异聚体，其特征是木犀草素的C2′位置与芹菜素的C6″位置相连（图S1）。反应过程中观察到颜色从黄色变为深橙棕色，这是酶促氧化的迹象。高分辨率质谱分析进一步通过不同于初始黄酮的峰证实了二聚体的形成（图2）。

结论

本研究建立了一种新的酶驱动路线，用于可控合成特定的黄酮二聚体——木犀草素同聚体和木犀草素-芹菜素异聚体，这些二聚体被认为是通过受调控的H₂O₂介导的自由基机制形成的。首次在巴基斯坦红茶中鉴定出这些二聚体，将我们的合成方法与自然环境直接联系起来，有力证明了酶驱动的氧化偶联是一个有意义的途径。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号31972462）和国家茶叶种质创新与资源利用重点实验室（SKLTEA-ZZ202521）的支持。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号31972462）的支持。

CRediT作者贡献声明

穆夫扎拉（Mufzala）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，数据可视化，方法学设计，实验研究，数据分析，概念构建。 李思瑞（Si-Rui Li）：方法学设计，实验研究。 宋娜（Na Song）：实验研究，数据分析。 李佳怡（Jia-Yi Li）：实验研究，数据分析。 杨子（Zi Yang）：项目管理。 张鹏（Peng Zhang）：概念构建。 张大伟（Da-Wei Zhang）：监督。 赛义德·阿希克·侯赛因（Syed Ashiq Hussain）：撰写 – 审稿与编辑。 玛丽亚姆·法蒂玛（Mariam Fatima）：撰写 – 审稿与编辑。 鲍冠华（Guan-Hu Bao）：撰写 – 审稿与...

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。