《Microchemical Journal》：Quality by design-enabled development of a robust reversed phase high performance liquid chromatography method for simultaneous estimation of lutein and dexamethasone in nanoformulations
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高效液相色谱法同步定量纳米制剂中的地塞米松和叶黄素，采用Analytical Quality by Design框架系统优化色谱条件，验证符合ICH标准，方法稳定可靠。
Keshav Hirave|Deepak B. Pemmaraju|Vikas Anand Saharan
印度阿萨姆邦卡姆鲁普区昌萨里781101邮政信箱，Sila Katamur（Halugurisuk），国家制药教育与研究学院（NIPER）制药技术系（制剂方向）
摘要
目的
本研究旨在采用分析质量设计（AQbD）方法，开发一种稳健的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，用于同时定量纳米制剂中的地塞米松（DEX）和叶黄素（LUT）。
方法
本研究采用了包含风险优先数分析的风险评估的系统性AQbD框架，并通过中心复合设计进行了优化。利用蒙特卡洛模拟确定了统计上可靠的方法操作区域（MODR）。色谱分离在C18柱上进行，流速为1.05 mL/min，地塞米松的检测波长为238 nm，叶黄素的检测波长为443 nm。方法验证遵循ICH Q2(R2)和ICH Q1A(R2)指南。纳米颗粒和脂质体分别通过改性的溶剂乳化-蒸发法和薄膜水合法制备，并对其粒径、多分散指数（PDI）、ζ电位、包封效率（EE %）和药物载量进行了表征。
结果
该方法在0.5–32 μg/mL的浓度范围内表现出优异的线性，精确度和准确度良好（%RSD ≤ 2%）。强制降解研究表明该方法具有特异性，且无降解产物干扰。纳米颗粒和脂质体的平均粒径分别为167.63 ± 47.21 nm和233.9 ± 31.57 nm。包封效率分别为68%至91.7%，药物载量分别为4.57 ± 0.92%和5.17 ± 0.40%。蒙特卡洛模拟证实了该方法在MODR范围内的高稳健性。
结论
成功开发、验证并应用了基于AQbD的RP-HPLC方法，用于纳米制剂中地塞米松和叶黄素的同步定量，证明了其稳健性、可靠性和适用于纳米制剂质量控制的适用性。
引言
基于纳米制剂的药物递送系统存在分析挑战，因为制剂中药物含量低，且含有多种复杂的成分，如聚合物、脂质、表面活性剂、稳定剂和其他辅料，这些成分可能干扰色谱性能和分析物回收[1]、[2]。此外，由于两种分析物在物理化学性质（如极性、溶解度和稳定性）上的差异，同时测定这两种分析物也是一项重要的分析挑战，这突显了开发稳健且优化过的色谱方法的必要性。传统的试错分析法往往无法满足这类复杂系统所需的严格稳健性和重现性标准。传统的HPLC方法开发耗时较长，且缺乏对分析方法过程参数之间相互作用的系统理解。为了克服这些挑战，分析质量设计（AQbD）提供了一个系统框架，用于识别和管理关键色谱参数，从而实现对复杂纳米制剂中分析物的可靠和生命周期相关的定量。
药物开发面临药物溶解度、渗透性和稳定性等挑战，这些因素会降低生物利用度[3]、[4]。基于纳米制剂的药物递送系统作为一种先进平台，可解决这些问题并提高药物的生物利用度。纳米制剂包括聚合物纳米颗粒、脂质载体、乳液和混合组成，用于改善药物释放模式并提升所有治疗领域的制剂特性。叶黄素（LUT）是一种膳食类黄酮类胡萝卜素，具有强大的抗氧化和抗炎活性，有助于保护视网膜免受氧化应激和光损伤[5]。地塞米松（DEX）是一种合成皮质类固醇，仍然是治疗眼部炎症和术后并发症的金标准抗炎药物[6]。将LUT和DEX整合到纳米制剂中是一种合理的治疗策略，可协同发挥抗氧化、抗炎和抗VEGF（抗血管内皮生长因子）作用，用于治疗年龄相关性黄斑变性[7]、[8]。同时测定LUT和DEX的分析挑战很大，因为它们的吸收峰值差异显著，LUT对光非常敏感，并且在应力条件下可能产生多种降解产物，因此需要针对具体情况进行高度优化的分析方法[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
正如ICH Q14指南所推荐的，AQbD范式提供了一个基于对方法变量及其对关键质量属性（CQA）影响的深入理解来设计分析方法的框架[14]。通过使用统计工具，AQbD有助于确定一个方法性能在整个产品生命周期内保持稳健、准确、可重复且符合法规要求的设计空间[15]。本研究开发并优化了一种基于AQbD的HPLC方法，用于聚合物纳米颗粒和脂质体中LUT和DEX的同步定量。采用系统风险评估和实验设计（DoE）研究了色谱参数（如流动相组成、pH值和流速）对关键分析响应（包括分辨率、保留时间和峰对称性）的影响。随后根据ICH Q2 (R2)指南对优化后的方法进行了特异性、线性、准确度、稳健性和灵敏度的验证[16]。该开发和验证的方法成功应用于LUT-DEX负载纳米制剂的分析，证明了其适用于常规分析物定量。
部分内容摘录
材料
叶黄素购自印度Dr. Sethi's Laboratories Pvt. Ltd.。地塞米松购自印度孟买的Yarrow Chem。胆固醇、HPLC级甲醇（99.7%）和乙腈（99.8%）购自印度Merck。岩藻多糖购自印度Yarrow Chem。低分子量壳聚糖（50–190 KDa）也购自印度Sigma。大豆磷脂酰胆碱购自美国Sigma-Aldrich Inc。磷酸二氢钾购自SRL。
吸收峰值的选取
通过紫外-可见光谱分析确定了DEX和LUT的最大吸光度。最大吸光度分别出现在238 nm和443 nm波长处，如图S2（补充文件）所示。所选波长产生的峰清晰且基线噪声最小，从而证实了其在建立的HPLC方法中的适用性。
分析质量设计（AQbD）方法开发和优化
优化使用JMP?（学生版）和FCCD实验设计进行
结论
本研究表明，分析质量设计（AQbD）框架能够开发出一种稳健的RP-HPLC方法，用于复杂纳米制剂基质中DEX和LUT的同时测定。该方法具有较高的分析回收率，能够准确测量药物包封情况，并确认其在纳米颗粒或脂质体基质存在下无干扰地定量药物的能力。所开发方法的良好性能表明了其可靠性。
CRediT作者贡献声明
Keshav Hirave：撰写——原始草稿、验证、软件、方法学、研究、数据分析、概念化。Deepak B. Pemmaraju：撰写——审阅与编辑、监督。Vikas Anand Saharan：撰写——审阅与编辑、监督、软件、资源管理、项目管理、方法学、概念化。
伦理声明
本文不包含任何作者进行的涉及人类和动物的研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
所有作者感谢印度化学与肥料部以及NIPER Guwahati的植物药理学和草药产品中心提供的研究设施和财务支持。
