《Microchemical Journal》：Integrating CRISPR-Cas12a/Cas13a and recombinase polymerase amplification in one tube for point-of-care testing: practices and innovations
编辑推荐：
本综述系统分析了RPA-Cas12a/Cas13a单管集成技术中五种核心策略（空间隔离、相分离、微流控、crRNA设计、反应组分优化），探讨其原理、优势与局限，并针对不同应用场景提出适配方案。当前技术仍面临便捷性、成本与普适性挑战，未来需结合AI驱动设计、模块化试剂开发及低成本微纳加工创新。
刘江源|陈玉康|康洪涛|吴慧玲|罗健|王佩|方瑶薇|高松
江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏省海洋生物产业技术创新联合创新中心，江苏海洋大学，连云港222005，中国
摘要
核酸的即时检测（POCT）要求具有高灵敏度、简单性和快速性，这推动了两种最常用的CRISPR-Cas酶Cas12a和Cas13a与重组酶聚合酶扩增（RPA）的结合。本文综述了这两种Cas酶的切割活性与基于RPA的扩增之间的生化不兼容性这一核心挑战，这种不兼容性阻碍了它们在单管检测中的集成。我们系统地总结了五种解决这一问题的关键策略：空间隔离（通过物理屏障或相变材料）、相分离（使用密度/粘度调节剂或琼脂糖凝胶）、微流控技术（利用离心力、毛细力、电场力或压力）、crRNA设计与修饰（PAM优化、光响应基团或DNA酶整合），以及反应组分优化（调整试剂浓度或添加添加剂）。详细分析了每种策略的原理、优点和局限性，并讨论了适用于不同应用场景的策略。尽管取得了显著进展，但目前的技术在便捷性、成本和通用性方面仍面临挑战。未来的发展方向包括基于人工智能的合理设计和高通量优化、模块化及冻干试剂的开发，以及低成本材料和微制造工艺的创新。本综述为推进单管RPA-Cas12a/Cas13a生物传感器的研发提供了全面的技术指导，有助于其在疾病诊断、食品安全和环境监测领域的更广泛应用。
引言
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas系统是原核生物中的一种进化适应性免疫机制，已被创新性地重新用于作为具有卓越精确度的可编程核酸操作工具[1]、[2]、[3]、[4]。其核心功能酶Cas核酸酶在CRISPR RNA（crRNA）的引导下，在核酸链中实现特异性磷酸二酯键的水解，已成为基因编辑和核酸生物传感器开发不可或缺的工具，应用范围涵盖了食品安全、疾病诊断和环境监测[5]、[6]、[7]。
在多种Cas效应器中，Cas12a和Cas13a因具有独特的强切割活性[8]、[9]而成为生物传感器开发中最广泛使用的酶。这一特性使它们区别于其他Cas蛋白，并构成了它们固有信号放大能力的分子基础。在crRNA的特异性识别和结合后，Cas12a和Cas13a不仅会对目标进行切割，还会非特异性地切割外源单链（ss）DNA和RNA报告分子[10]、[11]。这种对信号编码报告分子的广泛切割使得基于Cas12a/Cas13a的生物传感器能够高效放大信号，使其在检测低丰度核酸目标方面具有良好潜力[12]。然而，基于Cas12a/Cas13a的检测方法的固有灵敏度仅限于皮摩尔到飞摩尔范围，仍不足以满足当今生物传感器的超灵敏度要求[13]、[14]。
为了克服CRISPR-Cas12a/Cas13a检测系统的固有灵敏度限制，将其与核酸扩增技术结合已成为一种广泛采用的优化策略[15]、[16]、[17]。在迄今为止报道的各种扩增方法中，重组酶聚合酶扩增（RPA）作为Cas12a和Cas13a的最佳搭档脱颖而出，优于其他热循环和等温扩增技术，适用于即时检测（POCT）应用[18]。这种卓越的兼容性源于三个关键的生化与操作特性：首先，RPA在37–42°C的温和恒定温度下高效进行，这与Cas12a和Cas13a的最佳催化温度完全一致；其次，RPA的核心催化酶（重组酶和聚合酶）和Cas12a/Cas13a都依赖Mg2+作为其活性所需的辅因子，从而便于构建统一的扩增和切割反应缓冲系统；第三，RPA具有快速的扩增动力学和高效率，能够在短时间内生成足够的靶标扩增子，从而有效触发Cas12a/Cas13a介导的切割[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。RPA与Cas12a/Cas13a的结合催生了诸如DETECTR（DNA内切酶-靶向CRISPR转录报告系统，Cas12a-RPA）和SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁系统，Cas13a-RPA）等标志性核酸检测平台，这些平台实现了单拷贝水平的检测限，代表了核酸诊断领域的一项重大突破[29]、[30]。
传统的RPA-Cas12a/Cas13a检测方法采用分步两步流程，首先进行RPA介导的靶标扩增，然后将扩增产物手动转移到另一个反应容器中进行Cas12a/Cas13a介导的信号检测[29]、[30]。这种分段操作带来了两个关键的技术缺点：（1）显著增加了气溶胶和交叉污染的风险；（2）增加了操作复杂性，需要专业操作且检测时间较长[31]、[32]。这些限制严重阻碍了RPA-Cas12a/Cas13a检测技术在即时检测（POCT）中的应用，而即时检测的核心要求是简单性、快速性和现场操作性。为应对这些挑战，RPA扩增与Cas12a/Cas13a检测的单管集成已成为该技术发展的关键和必然方向[18]、[33]、[34]、[35]、[36]。
单管RPA-Cas12a/Cas13a检测的发展受到一个核心技术瓶颈的阻碍，即RPA扩增与Cas12a/Cas13a催化之间的固有生化不兼容性。Cas12a和Cas13a的非特异性切割活性可能在RPA介导的扩增早期无意中降解关键的RPA反应组分，包括单链引物、模板和新兴的扩增产物[37]、[38]。这种意外的脱靶切割会降低RPA扩增效率，最终影响单管检测的灵敏度、重现性和稳健性[30]、[36]、[39]、[40]。因此，解决这种生化不兼容性是开发高性能单管RPA-Cas12a/Cas13a检测平台的核心挑战和关键研究重点。
已有几篇综述总结了CRISPR-Cas系统与等温核酸扩增技术单管整合的一般策略[37]、[41]、[42]、[43]。相比之下，本文专门关注单管RPA-Cas12a/Cas13a系统，这是两种最相关的Cas效应器与广泛用于即时检测的等温扩增技术的具体组合。通过系统总结实现高效单管整合的各种策略，并深入分析每种策略的关键技术路线、固有优势和实际局限性，本文旨在为单管RPA-Cas12a/Cas13a生物传感器的合理设计、开发和转化应用提供有价值且实用的指导。
部分摘录
空间隔离
为了将Cas12a/Cas13a和RPA集成在一个管中，空间隔离策略将Cas催化和RPA分隔在单个反应管内。下面我们总结了文献中报道的代表性空间隔离方法的原理（表1）。
最直接的方法是利用小液滴的表面张力来物理分离两种反应（图1A），即将Cas和RPA反应混合物放置在同一管内的不同位置
优点、局限性和应用场景
本文全面阐述了CRISPR-Cas12a/Cas13a与RPA单管整合的五种核心策略。空间隔离通过管状结构或相变材料在单个封闭容器内物理分离RPA和Cas12a/Cas12a反应系统，使得设备配置相对简单，实现封闭管操作。相分离则通过利用密度梯度、粘度差异或固液界面来构建动态的反应微环境，
CRediT作者贡献声明
刘江源：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析。陈玉康：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析。康洪涛：方法学、研究、数据分析。吴慧玲：研究、数据分析。罗健：数据分析。王佩：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念构思。方瑶薇：监督、方法学，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国江苏省基础研究计划（编号BK20241088）、中国江苏省高等学校自然科学基金（编号24KJB180026）、中国盐城市重点研发计划（编号YCBE202439）、江苏省海洋生物资源与环境重点实验室开放基金（编号SH20221208和SH20231212）以及江苏省研究生研究与实践创新计划的支持
