通过工程改造的自杀型载体介导的基因组编辑技术，对分枝杆菌LY-1进行基因改造，以实现靶向调控9α-羟基雄烯-4-烯-3,17-二酮的生物合成过程

《Process Biochemistry》：An engineered suicide vector-mediated genome editing of Mycobacterium sp. LY-1 for targeted 9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione biosynthesis

基因编辑技术优化及甾体生物转化应用。通过构建自杀质粒系统p2NILB，结合sacB反选择标记和ku/ligD基因敲除，使基因敲除效率提升至70%以上。代谢工程方面，敲除kstD1等关键酶并过表达KshA2，结合mmpL3转运蛋白敲除及优化溶剂系统，实现9α-OH-AD产量达15.71 g/L。

　　

徐立阳|王玉佳|严飞宇|潘文静|童英佳|龚金松|张小梅|史金松|徐正宏|李慧

江南大学生命科学与健康工程学院，中国无锡214122

摘要

Mycolicibacterium是类固醇生物转化的重要工业宿主，但其基因工程长期以来受到低效的同源重组（HR）和强烈的非同源末端连接（NHEJ）活性的限制。在这里，我们建立并优化了一种基于自杀质粒的Mycobacterium sp. LY-1基因组编辑系统。构建的载体p2NILB结合了卡那霉素选择和sacB介导的逆向选择，实现了精确且无标记的等位基因交换。通过删除ku或ligD来抑制NHEJ，并优化同源臂长度，将基因敲除效率提高到70%以上。该优化平台随后被应用于类固醇降解的代谢工程，以增强9α-羟基雄烯二酮（9α-OH-AD）的生物合成。连续删除五个kstD同工酶阻断了下游类固醇的降解，其中kstD1被确定为产物损失的主要因素。功能分析表明KshA2是关键的9α-羟化酶，其过表达使9α-OH-AD的浓度提高到3.41 g/L。此外，删除支链酸转运基因mmpL3后，9α-OH-AD的产量进一步提高到4.19 g/L。为了克服高植物甾醇负荷条件下的底物利用限制，使用大豆油-Tween 80溶剂系统克服了底物限制，从30 g/L的植物甾醇中产生了15.71 g/L的9α-OH-AD。本研究为类固醇产生放线菌的基因工程提供了一个强大的框架和有效策略。

引言

Mycolicibacterium是一种非结核分枝杆菌，具有吸收甾醇并高效降解其侧链的能力[1]。由于其独特且发育良好的甾醇代谢网络，该菌株能够将廉价的底物（如植物甾醇）转化为一系列高价值的类固醇核中间体。Mycolicibacterium产生的代表性产物包括雄烯-4-烯-3,17-二酮（AD）、9α-羟基雄烯-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）、11α-羟基雄烯-4-烯-3,17-二酮（11α-OH-AD）和22-羟基-23,24-双诺尔醇-4-烯-3-酮（4-HBC）。在这些中间体中，9α-OH-AD是一种关键的类固醇前体，具有典型的环戊烷-吡喃类固醇骨架，广泛用于合成糖皮质激素抗炎药物，如氢化可的松、泼尼松及其衍生物[2]、[3]。

近年来，用于9α-OH-AD生物合成的微生物细胞工厂的建设取得了显著进展。Zhang等人阐明了M. fortuitum中参与甾醇代谢的关键酶系统[4]。通过精确敲除非必需的竞争途径，他们成功实现了碳代谢通量的定向重新分配，9α-OH-AD的纯度达到94.96%，摩尔产率为87.17%。同时，Zhu等人在M. neoaurum中建立了一种动态代谢通量平衡策略[5]。通过协调调节甾醇侧链降解酶和9α-羟化酶的表达水平，他们进一步增强了工业菌株在高底物负荷条件下的生理稳定性。

为了提高9α-OH-AD的产量，对分枝杆菌进行成功的代谢工程改造在很大程度上依赖于强大的分子遗传工具的可用性。已经为分枝杆菌开发了多种分子遗传工具，如转座子诱变、电穿孔和噬菌体介导的重组。其中，转座子诱变具有全基因组覆盖和适合大规模突变筛选的优势；然而，转座子插入的完全随机性使其不适合精确的基因敲除、点突变或调控元件工程[6]。电穿孔通过高强度电脉冲暂时破坏细胞膜，实现DNA的直接导入，无需制备感受态细胞或结合系统。尽管这种方法操作简单且构建周期短，但其转化效率高度依赖于细胞生理状态和培养条件。此外，电穿孔往往无法稳定引入大DNA片段，从而限制了其在复杂基因组工程任务中的应用[7]。专门的转导方法显著提高了分枝杆菌中靶向遗传操作的精度，允许高效插入或替换目标基因，并大大缩短了突变体构建所需的时间。然而，这种方法受到宿主范围狭窄、感染效率低和稳定性差以及基因组载量有限的限制[8]。近年来，CRISPR-Cas系统的引入显著推进了分枝杆菌的遗传操作。CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas9介导的DNA双链断裂实现了可调节的无标记基因抑制和基因组编辑[9]。然而，基于CRISPR的分支杆菌编辑仍面临一些挑战。这些生物主要依赖非同源末端连接（NHEJ）进行DNA修复，导致gRNA构建和转化效率低以及HR效率低[10]。此外，分枝杆菌基因组的高GC含量进一步限制了靶位点的选择[11]。Yan等人在M. smegmatis中应用Cas12a与MmNHEJ结合时，仅获得了0.75%的编辑转化体，表明编辑效率极低[12]。类似地，Donavan等人评估了Cas9在M. abscessus中的适用性，报告的单基因敲除效率在1.1%到9.3%之间[13]。尽管这些值比传统的HR有所改进，但总体编辑效率仍不足以支持复杂的代谢工程和多重基因组修饰。

分枝杆菌中的CRISPR-Cas系统常常受到NHEJ主导的DNA修复机制的限制，其HR效率本身就很低。相比之下，基于HR的自杀质粒结合在这些细菌中得到了系统的验证，显示出高编辑准确性和稳定的遗传传递特性。Parish和Stoker首次使用非复制载体p2NIL以及< />和lacZ逆向选择标记，成功实现了M. tuberculosis中多个基因的无标记删除和替换[14]。随后，Arnold等人开发了一个统一的分枝杆菌遗传学克隆平台，将非复制载体与逆向选择模块集成在一起，从而实现了跨多个分枝杆菌物种的可靠无标记基因组修饰[15]。此外，Liu等人最近在M. neoaurum中结合了经典的自杀质粒介导的等位基因交换策略和Att/Int位点特异性重组系统，实现了多重和迭代的基因组工程，为构建复杂基因型提供了有效方法[16]。总体而言，这些研究表明，在对DNA损伤敏感且以NHEJ为主修复的分枝杆菌中，基于自杀质粒的双交叉HR仍然是一个成熟、稳健且高度兼容的基因组工程解决方案。

在Mycobacterium sp. LY-1中开发高效可靠的基因组工程策略对于合理的代谢重建至关重要。在这项研究中，我们建立并优化了一种基于自杀质粒的等位基因交换系统，实现了这种工业宿主的精确无标记基因组修饰。通过整合正向选择、sacB介导的逆向选择和提高的HR效率，该平台为系统性的菌株工程提供了稳健和遗传稳定的基础。利用这一优化框架，对参与甾醇侧链降解和类固醇核修饰的关键代谢节点进行了工程改造，将代谢通量重新导向9α-OH-AD的生物合成。同时，对内源性类固醇修饰酶的功能分析确定了影响产物积累的限速步骤。此外，还实施了过程级优化，以缓解高植物甾醇负荷下的质量传递限制，从而提高了底物的可用性和生物转化效率。总体而言，这项工作为Mycobacterium sp. LY-1的高水平9α-OH-AD生产提供了综合的基因组工程和代谢优化策略，并为构建类固醇产生细胞工厂提供了实用框架。

化学品和试剂

除非另有说明，本研究中使用的试剂均来自中国上海的Sinopharm。植物甾醇（β-谷甾醇40.50%、菜籽甾醇23.82%、豆甾醇24.96%、油菜甾醇1.07%）购自中国陕西的Qionghua Biotech。9α-OH-AD标准品购自中国上海的Aladdin。2 × Phanta Max Master Mix（Dye Plus）和One Step Cloning Kit购自中国南京的Vazyme Biotech。所有限制性酶和T4 DNA连接酶均来自

在Mycobacterium sp. LY-1中构建自杀载体系统

自杀质粒系统通过使用非复制载体为细菌提供了高效的基因组工程平台[18]、[19]。其基本原理依赖于HR介导的质粒整合到染色体中[20]。我们采用了两步等位基因交换策略来实现精确的遗传修饰。第一步是将携带同源臂和正向选择标记的自杀质粒通过单交叉整合到染色体中

结论

在这项研究中，我们开发了一种系统性和多层次的优化策略，以克服Mycobacterium sp. LY-1在类固醇生物转化方面的遗传和过程限制。优化的基于p2NILB的自杀载体平台实现了可靠且无标记的基因组编辑，通过合理调节DNA修复途径，将等位基因交换效率从34.9%提高到61.3%，供体模板的优化进一步将敲除效率提高到70%以上。

CRediT作者贡献声明

张小梅：监督、方法学、概念化。史金松：验证、监督、形式分析。童英佳：验证、监督、形式分析。龚金松：方法学、形式分析。徐正宏：监督、项目管理、概念化。李慧：写作——审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、形式分析、概念化。严飞宇：方法学、研究。潘文静：研究、数据管理。徐立阳：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（编号2024YFA0917900）和中央高校基本科研业务费（项目编号JUSRP202504023）的支持。