《Nature Communications》：Skeletal editing via multi-step engineering of a modular polyketide synthase
编辑推荐：
本研究旨在解决模块化聚酮合酶（PKS）重组编程活性降低的难题。研究人员通过结合体外CRISPR/Cas9基因编辑与异源表达技术，对mediomycin PKS进行多步模块编辑，成功以高产率（82 ± 3 mg/L）重构了难以获得的药物先导分子四纤维蛋白（tetrafibricin），并证明了硫酯酶（TE）结构域替换策略的有效性。这为理性重编程PKS以获取复杂目标分子开辟了新途径。
在生命体这座精密的化学工厂中，自然界的设计师——酶，能够高效合成出结构复杂、功能多样的有机分子，其中许多已成为人类重要的药物来源。聚酮化合物（Polyketides）就是这样一个庞大的明星家族，包括了红霉素、阿霉素等众多临床药物。它们的合成依赖于一种称为模块化聚酮合酶（Modular Polyketide Synthase, PKS）的分子机器。这种机器如同一条高度自动化的“装配线”，其“工作站”（模块）的排列顺序严格决定了最终产物的碳骨架结构。这种美妙的“序列-结构”对应关系，曾让科学家们满怀憧憬：如果能像编程软件一样重新编排这条装配线，岂不是可以随心所欲地制造出任何我们想要的复杂分子，包括那些难以通过传统化学方法合成的候选药物？
遗憾的是，现实远比理想骨感。尽管PKS的模块化架构看似为“设计者 biosynthesis”提供了完美平台，但科学家们发现，一旦试图对这些精密的生物合成机器进行“重组编程”，往往会导致其功能严重受损，产量急剧下降。如何在不牺牲“生产力”的前提下，可靠地重编辑PKS，从而获取具有特定结构和活性的目标分子，成为了合成生物学和天然产物化学领域一个长期悬而未决的核心挑战。发表在《Nature Communications》上的这项研究，正是为了攻克这一难题而生。
为了实现对PKS的精准、高效编辑，研究人员综合运用了多项关键技术。首先，他们采用了高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术，在体外对编码mediomycin PKS的基因簇进行精确的靶向切割与修改。随后，通过异源表达（Heterologous expression）技术，将编辑后的基因簇导入合适的宿主细胞中进行功能表达与产物生产。在编辑策略上，研究团队没有盲目选择切割位点，而是基于进化分析，确定了一个位于酰基转移酶（Acyltransferase, AT）结构域下游的、进化上更支持的“热点”作为模块编辑的切割位点，这被认为是实现高效编辑的关键。此外，研究也运用了硫酯酶（Thioesterase, TE）结构域替换（swapping）的策略，以改变产物的环化方式。
模块化PKS的五步编辑与四纤维蛋白的高效合成
为了验证理性编辑策略的可行性，研究团队选择了一个高价值目标分子——四纤维蛋白（tetrafibricin）。这是一种纤维蛋白原受体（fibrinogen receptor）的抑制剂，具有重要的药物开发潜力，但其获取十分困难。研究人员对负责合成mediomycin的PKS装配线进行了大刀阔斧的五步模块编辑。他们像更换乐高积木一样，精确替换了多个延伸模块。令人振奋的是，经过如此复杂的改造，改造后的PKS“装配线”依然保持了旺盛的生产力，成功合成了目标产物四纤维蛋白，产量高达82 ± 3 mg/L。尽管经过五步编辑后，整体生产力保留了原始系统的26%，但这一产量水平已足以证明该策略的高效性和实用性，标志着在保持PKS活性方面取得了重要突破。
硫酯酶结构域替换实现大环氨基多元醇的获取
除了对延伸模块进行编辑，研究还探索了在装配线末端进行改造的可能性。聚酮链的释放和环化由硫酯酶（TE）结构域控制。研究人员将原始的TE结构域替换为来自另一个PKS系统的TE结构域。这一操作成功地改变了产物的环化方式，从而获得了另一种结构不同的分子——一种大环氨基多元醇（macrocyclic aminopolyol）。这个结果证明，TE结构域的“即插即用”式替换是一种有效的策略，可以用于快速产生结构多样性的聚酮化合物库，拓展了PKS工程化的工具箱。
结论与意义
本研究成功地建立了一种高效、可靠的PKS工程化“最佳实践”。通过结合体外CRISPR/Cas9编辑和异源表达，并利用进化支持的AT域下游位点作为模块编辑的“热点”，研究人员实现了对mediomycin PKS长达五步的模块重编程，且没有造成合成活性的严重丧失，最终以可观的产量合成了难以获得的药物先导分子四纤维蛋白。同时，通过硫酯酶结构域的替换，也实现了产物环化模式的改变，获得了新的大环氨基多元醇。
这项研究的成功具有多重重要意义。首先，它在实践上验证了理性、多步重编程模块化PKS的可行性，打破了以往编辑必伴随活性大幅下降的瓶颈，为利用PKS作为平台生产非天然复杂分子提供了关键的方法学支撑。其次，研究确立的编辑策略（特别是进化支持切割位点的选择）为后续的PKS工程化提供了可遵循的范例，有望推广到其他PKS系统。最终，这项工作朝着“设计者biosynthesis”的终极目标迈出了坚实的一步，为按需创造具有特定生物活性的复杂有机分子，尤其是那些传统化学合成极具挑战性的药物候选化合物，开辟了一条崭新的、高效的生物制造途径。
