《Horticulturae》：Genome-Wide Analysis of Shaggy-like Kinase (SK) Family Genes in Brassica rapa and Functional Characterization of BrSKβ-2 in Pollen Development
Tianci Hu,
Junping Yang,
Yu Lan,
Ying Huang,
Shanxin Zhong and
Xiangshu Dong
编辑推荐：
本研究聚焦于芸苔属重要作物白菜（Brassica rapa）的SHAGGY-like激酶（SK）基因家族。研究人员通过全基因组分析鉴定出18个BrSK成员，并通过表达谱和共表达分析发现BrSKβ-1和BrSKβ-2在可育花蕾中特异性表达，并与花粉发育相关基因共表达。利用CRISPR/Cas9技术敲除BrSKβ-2导致花粉异常率高达25–65%，且形态正常花粉萌发率降至仅10%，证实其对雄性育性至关重要。该研究为芸苔属作物SK基因家族的功能研究提供了系统见解，并将BrSKβ-2定位为基于基因编辑构建雄性不育系统的潜在靶点，对杂交育种具有重要意义。
植物的繁衍生息离不开精妙的花粉发育过程。在重要的芸苔属作物，如白菜中，雄性不育是杂交育种的关键技术之一，而许多雄性不育的表现往往伴随着花粉的缺陷。SHAGGY-like激酶（SK）基因家族在植物中扮演着多重角色，调控着从发育到非生物胁迫响应的各种过程。虽然其在模式植物拟南芥和水稻中已得到广泛研究，但在具有重要经济价值的白菜中，我们对这个基因家族的了解却相当有限。这留下了一个关键的知识空白：白菜的SK基因家族有哪些成员？它们与拟南芥的对应基因在进化和功能上有何关联？更重要的是，其中是否有成员在花粉发育中发挥关键作用，从而可能成为操控雄性育性的“开关”？为了填补这些空白，一支研究团队开展了一项系统性的研究，其成果发表于《Horticulturae》期刊。
研究人员综合运用了多种生物信息学和分子生物学技术来回答上述问题。首先，他们利用生物信息学方法，基于已知的拟南芥SK蛋白序列，在三个二倍体芸苔属物种（白菜、黑芥、甘蓝）的基因组数据库中进行了同源搜索和鉴定，并通过系统发育分析对其进行分类。为了探究基因功能，研究团队从公共数据库获取了覆盖白菜59个不同器官/组织的RNA测序（RNA-seq）数据，以及5种不同基因型雄性不育系的RNA-seq数据，进行了深入的表达谱分析和共表达网络构建。最后，为了在体内验证候选基因的功能，他们采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对候选基因BrSKβ-2设计并构建了敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了白菜突变体植株，随后通过基因组测序确认编辑事件，并通过亚历山大染色和体外花粉萌发实验对突变体的花粉育性进行了表型鉴定。
3.1. Identification and Phylogenetic Analysis of BrSK Proteins
研究人员在白菜、黑芥和甘蓝中分别鉴定出18、16和18个SK蛋白，数量约为拟南芥（10个）的1.6至1.8倍，这源于芸苔属进化过程中的基因扩张。系统发育分析将所有SK蛋白分为四个主要分支（I-IV），与拟南芥中的分类一致，但发现AtSKι和AtSKδ在白菜中没有直系同源物，暗示其功能可能被其他BrSKs取代。
3.2. Gene Structure and Protein Motif Analysis of BrSKs
基因结构和蛋白质基序分析表明，同一亚组内的SK成员具有相似的外显子-内含子结构和保守的基序排列。MEME分析在所有62个SK序列中鉴定出10个保守基序，其中大部分包含了糖原合酶激酶3（GSK3）结构域序列，这支持了它们在激酶功能上的保守性。
3.3. Tissue Expression of BrSKs Reveals BrSKβs Involved in Pollen Development
通过对59个组织的RNA-seq数据分析发现，除了BrSKγ-3，其他BrSK基因在54个组织样本中均有表达。其中，BrSKβ-1和BrSKβ-2在花蕾（III至V期）和开放花朵中优势表达。进一步对五种不同雄性不育系的表达分析证实，这两个基因在可育花蕾中高表达，且BrSKβ-2的表达量高于BrSKβ-1，提示它们可能在花粉发育中扮演角色。
共表达分析和基因本体（GO）富集分析揭示，与BrSKβ-1和BrSKβ-2共表达的基因显著富集在“花粉精细胞分化”、“花粉发育”和“花粉管生长”等生物过程。但两者也存在差异，例如花粉发育相关基因DUO1与两者均共表达，而BCP1仅与BrSKβ-1共表达，C4H仅与BrSKβ-2共表达。
3.4. Verification of the Function of BrSKβ-2 During Pollen Development
为了直接验证BrSKβ-2的功能，研究人员利用CRISPR/Cas9系统成功构建了BrSKβ-2的敲除突变体。测序证实突变体在靶位点发生了插入或缺失突变，导致蛋白质翻译提前终止。表型分析显示，与野生型相比，BrSKβ-2突变体产生了25%至65%的败育花粉粒。更关键的是，那些形态看似正常的花粉粒，其体外萌发率也急剧下降至仅约10%。这确凿地证明了BrSKβ-2对于白菜的正常花粉发育和萌发，即雄性育性，是必不可少的。
研究结论与意义
本研究首次在白菜中系统鉴定了SHAGGY-like激酶（SK）基因家族，共发现18个成员，并阐明了它们的进化关系、基因结构和表达模式。研究的核心发现是，两个ASKβ的直系同源基因——BrSKβ-1和BrSKβ-2——在可育花蕾中特异性高表达，且其共表达网络与花粉发育过程紧密相连。尤其重要的是，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究者直接证明了BrSKβ-2的功能缺失会导致严重的花粉败育和萌发缺陷，从而明确其是维持白菜雄性育性的关键基因。
这项研究的意义是多方面的。首先，它填补了芸苔属作物中SK基因家族功能研究的空白，为理解这个重要激酶家族在作物中的进化与功能分化提供了新见解。其次，它将BrSKβ-2定位为一个调控雄性育性的关键“开关”。在杂交育种中，雄性不育系是生产杂交种子的高效工具。该研究表明，通过精准编辑BrSKβ-2，可以有效创制雄性不育材料，这为开发新型的、基于基因编辑的雄性不育系统提供了直接的理论依据和优秀的候选靶点。因此，这项研究不仅增进了我们对植物生殖生物学的基础认知，更具有推动芸苔属作物（如白菜、油菜等）杂交育种技术发展的潜在应用价值。
