基于分子对接和分子动力学技术的替米考星核酸适配体的模拟构建

《Analytica Chimica Acta》：Simulated Construction of Tilmicosin Nucleic Acid Aptamers Based on Molecular Docking and Molecular Dynamics Techniques

本研究提出基于单核苷酸对接组装的aptamer设计新方法，以tilmicosin为模型靶标，通过分子动力学模拟和饱和对接筛选出32个高亲和力单核苷酸，结合DFS算法和加权图论模型获得63条非冗余候选序列。最优aptamer Til-14经荧光和胶体金法验证，亲和力达298.16±95.588 nM，特异性显著优于传统SELEX方法。该策略有效解决了小分子aptamer筛选效率低的问题，建立了可扩展的靶向筛选框架。

　　

张宏宇|孙华青|毛喜英|张欣|史明|王一民|李坤

河北省秦皇岛市燕山大学环境与化学工程学院，邮编066004，中国

摘要

背景

传统的适配体筛选方法对于小分子靶标往往效果不佳，这主要是由于这类化合物的固有结构限制。它们简单的结构、有限的功能基团以及受限的空间复杂性极大地降低了识别出同时具有高亲和力和特异性的核酸序列的概率。因此，筛选过程变得效率低下且劳动强度大，经常无法获得适用于实际应用的满意性能的适配体。这在扩展适配体在小分子检测和治疗中的应用方面构成了一个重要的技术障碍。

结果

基于此，本研究创新性地提出了一种基于单核苷酸对接组装的适配体设计方法，并以小分子替米考星为例进行了研究。通过分子动力学模拟（50纳秒，RMSD收敛阈值为0.15纳米），分析了替米考星的动态构象特征。随后，对四类单核苷酸进行了饱和对接，筛选出了32个高亲和力的单核苷酸（原子接触距离≤4埃）。引入了深度优先搜索算法（DFS）和加权图理论模型等方法，获得了八类功能模块的代表性单核苷酸，并最终筛选出63个非冗余的候选序列。分子对接结果表明，最优适配体Til-14与替米考星具有高亲和力，通过SYBR Green I荧光测定法测得的亲和力为298.16 ± 95.588纳摩尔。胶体金比色分析也证实了其高亲和力（Kd = 279.323 ± 87.234纳摩尔）和出色的特异性。

意义

这种创新方法成功解决了传统SELEX方法在筛选小分子靶标适配体时的关键局限性。通过提高选择的效率和特异性，它不仅促进了高性能适配体的发现，还为构建针对其他小分子的核酸适配体提供了一个新颖且可推广的框架。

引言

替米考星是一种第三代大环内酯类兽医抗生素，在预防和治疗牲畜/家禽的呼吸系统疾病中发挥着不可替代的作用。其作用机制是特异性结合到细菌核糖体50S亚基的23S rRNA结构域上，从而抑制肽基转移酶的活性，进而阻断蛋白质合成的延伸过程(1),(2),(3),(4)。虽然替米考星具有广谱抗菌活性和长效缓释特性，但这些优势同时也增加了动物源性食品中药物残留的风险^5。这些残留物带来了双重威胁：(1)通过饮食暴露引发过敏反应；(2)在亚抑制浓度下诱导细菌的SOS反应。后者通过水平基因转移（HGT）促进了多重耐药性（MDR）基因的跨物种传播，主要通过接合质粒介导(6),(7)。因此，迫切需要开发快速准确的残留物检测方法以确保食品安全和公共卫生。目前，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是金标准技术，其检测限可低至0.1微克/千克^8。然而，LC-MS/MS存在一些已知的局限性，限制了其广泛应用。该技术需要超过50万美元的仪器投资，并且分析速度相对较慢，平均每个样本需要30分钟。相比之下，快速免疫测定法可以在5分钟内完成检测，而传统的LC-MS/MS系统在没有自动化设备的情况下每天通常只能处理不到50个样本。这些因素共同导致了LC-MS/MS在发展中国家食品安全检测站的应用率仅为约12%(9),(10)。

在这种背景下，基于适配体的快速检测技术应运而生。适配体——通过系统进化富集（SELEX）选出的单链DNA/RNA寡核苷酸——表现出纳摩尔级别的结合亲和力（Kd = 10^-100纳摩尔）、成本效益高以及快速的目标识别能力（<15分钟）。它们的模块化结构使其能够合理设计用于多功能生物传感应用(11),(12),(13),(14)。然而，传统的SELEX方法在筛选小分子适配体时存在固有局限性：(1)结构界面有限；(2)功能基团稀缺；(3)多轮筛选成本高昂(15),(16),(17)。这些因素严重阻碍了基于适配体的兽医药物监测的实际应用。最近，计算生物学的进步通过与分子建模的深度整合彻底改变了这一状况。特别是对接模拟能够精确预测：(i)结合构象；(ii)自由能（Δg ≤ -10千卡/摩尔^18）。分子动力学（MD）模拟利用基于物理的计算算法数值求解牛顿运动方程。这种方法能够在定义的热力学条件下（例如，300K下的NPT系综）进行原子级轨迹分析，从而阐明分子系统的时间演化及其潜在的机制行为^19。分子对接和分子动力学（MD）模拟的协同整合为适配体开发建立了强大的计算框架。这种双重方法实现了适配体-靶标结合构象的原子级预测（RMSD <2.0埃），并能够对结合自由能景观进行时间分辨评估（ΔG <1.5千卡/摩尔）。除了对动态结合机制的基本洞察外，模拟得到的参数还直接指导了两个关键工程过程：基于结构的适配体截短和数据优化的碱基突变，最终实现了高性能适配体探针的精确设计(20),(21)。Majid Sharifian等人通过分子动力学模拟证明三种适配体能够有效结合并检测多巴胺，其中44个核苷酸长的DNA适配体显示出最高的结合亲和力^22。Song等人采用从头算设计与分子对接/MD模拟相结合的方法开发了一种高亲和力、特异性的奥卡迪酸适配体，并通过实验进行了验证^23。

我们通过优化单核苷酸对接组装方法（Song等人提出的方法）开发了一种简化的适配体设计策略。以替米考星为模型靶标，我们对所有四种核苷酸进行了全面的饱和对接，随后进行了基于亲和力的筛选和基于距离的组装，以生成稳定的适配体。分子对接结果表明，最优适配体Til-14与替米考星具有高亲和力，通过SYBR Green I荧光测定法测得的亲和力为298.16 ± 95.588纳摩尔。胶体金比色分析也证实了其高亲和力（Kd = 279.323 ± 87.234纳摩尔）和出色的特异性。这种方法为高通量开发小分子结合适配体建立了一个经过验证的、可扩展的平台。

软件和试剂仪器

软件介绍：替米考星的三维结构（PubChem CID：5282521）从PubChem数据库中获取（URL：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）^24；分子动力学模拟使用GROMACS 2023.2进行（http://www.gromacs.org）^25。小分子拓扑参数使用OpenBabel生成（https://openbabel.org/），原子部分电荷通过RESP2方法分配，并根据量子力学扭转扫描优化了键合参数。

结果

本研究基于“基于单核苷酸对接的组装”方法，其核心在于“基于结构的合理设计”。具体来说，本研究首先使用分子对接技术获得了替米考星的最优构象。通过饱和分子对接，我们系统地识别了所有具有潜在有利相互作用的热点区域，并清楚地记录了相应的核苷酸类型和方向，从而构建了一个计算模型

讨论与结论

我们通过单核苷酸对接组装开发了一种简化的适配体设计策略，成功构建了针对替米考星的特异性适配体。分子动力学模拟（50纳秒，RMSD <0.15纳米）为四种核苷酸的饱和对接提供了稳定的替米考星构象，筛选出了32个高亲和力的候选序列。PyMOL可视化和深度优先搜索（DFS）聚类识别出了八个功能模块，并通过

CRediT作者贡献声明

李坤：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。史明：软件，方法学。王一民：资金获取，正式分析。毛喜英：研究，资金获取。张欣：资源，研究。张宏宇：撰写 – 原始草稿。孙华青：正式分析，数据管理

未引用参考文献

(8)。

利益冲突

作者声明没有利益冲突

数据和软件可用性

数据集引用

张宏宇（2025）。原始文件：替米考星分子动力学和对接数据集（版本1.0.0）[数据]。GitHub。https://github.com/hongyuzhang0000/Original-file

描述

该存储库包含：

替米考星的分子动力学模拟数据（0ns-50ns轨迹文件，格式为.pdb）。

30种饱和分子的对接结果（A 30docking.pdb, C 30docking.pdb等）。

软件依赖

所有软件参数和实施协议详见“材料”部分

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了河北省引言外国情报项目（关于磁性靶向干细胞对肝脏损伤的干预效果研究）；河北省研究生创新资助项目（CN）[项目编号CXZZBS2025068]的支持；