诊断与治疗智能探针：用于肿瘤及ROS（活性氧）增强型癌症光动力疗法中硫醇检测的光声/荧光双模态技术

《Analytica Chimica Acta》：Diagnostic and Therapeutic Intelligent Probe: Photoacoustic/ Fluorescent Dual-Modality of Thiols Detection in Tumor and ROS-potentiated Cancer Photodynamic Therapy

精准肿瘤定位与根除：基于近红外荧光/光声双模态成像的MB-2O-MB探针开发及其协同光动力治疗机制研究。

　　

苏晓燕|曾瑞峰|李洪宇|兰彩米|姜能|丁月|兰金帅|张彤|易廷庄

肿瘤科，右江民族医学院附属医院/广西肝胆疾病临床医学研究中心/广西高等教育胃肠微生态与健康工程研究中心/百色市胃肠微生态与健康重点实验室，中国广西百色市533000

摘要

诊断整合技术是癌症诊断和治疗领域的一项重要进展。基于荧光探针的成像方法与光动力疗法（PDT）的结合具有显著优势，因为其具有高灵敏度和微创性。然而，荧光成像的有效检测深度和空间分辨率受到生物组织中光散射效应的限制。此外，肿瘤微环境（TME）中高浓度的谷胱甘肽（GSH）会中和PDT产生的活性氧（ROS），直接抑制治疗效果。因此，开发一种高灵敏度、高分辨率的荧光探针以实现肿瘤诊断和治疗的整合具有重要意义。本研究开发了一种可激活的诊断-治疗探针MB-2O-MB。在MB-2O-MB中，亚甲蓝（MB）同时作为光敏剂和信号报告基团，同时引入了对巯基敏感的二硫键作为连接剂和响应单元。当探针与肿瘤区域的GSH反应时，二硫键断裂，导致结构解离并释放出自由的MB分子。实验表明，该探针表现出较强的抗干扰能力，并且对这种反应具有高灵敏度（LOD = 57.99 nM）。此外，探针激活后产生的光声（PA）信号弥补了荧光成像有限的组织穿透深度，使得肿瘤区域的空间定位更加精确。在治疗方面，当用660纳米近红外（NIR）激光照射时，释放的MB能有效生成单线态氧，从而有效诱导4T1肿瘤细胞死亡。体内数据进一步验证了MB-2O-MB通过PDT的显著肿瘤抑制效果。总之，MB-2O-MB通过NIR荧光/PA双模态成像和PDT的协同作用实现了精确的肿瘤定位和完全清除。这一策略同时克服了传统光动力疗法的耐药性瓶颈和成像限制，为构建高选择性和强效的智能诊断和治疗系统开辟了新途径，显著推动了精准医学的发展。

引言

肿瘤组织的精确成像对于临床诊断和手术干预至关重要。然而，准确区分肿瘤病变与正常组织仍然是一个重大挑战[1]、[2]、[3]。这一挑战主要源于肿瘤特有的病理生理特征，包括氧化还原失衡、ROS和GSH水平升高、特定酶的过度表达以及酸性的TME [4]、[5]、[6]。作为细胞内最丰富的非蛋白质巯基化合物和关键的抗氧化剂，GSH在维持氧化还原平衡、代谢外源性物质和调节基因表达等核心生理过程中起着重要作用[7]、[8]。异常升高的GSH水平不仅与肿瘤发生、进展、转移和不良预后（例如透明细胞肾细胞癌）密切相关，其巯基的强还原能力也深刻影响癌细胞的生物学特性[9]、[10]、[11]、[12]。研究表明，肿瘤细胞中的GSH浓度可以是正常细胞的10倍，达到毫摩尔水平（0.5-10 mM），远高于其他体内的巯基化合物[13]、[14]。这使得多种GSH响应分子探针能够高效激活，使其成为非常有前景的肿瘤成像生物标志物[15]、[16]。因此，实时监测和调节TME中的GSH变化对于癌症的精确诊断和治疗至关重要。

荧光成像，特别是在NIR荧光领域，是一种强大的技术，具有高时空分辨率、优异的灵敏度、实时能力和非侵入性。这些特性使其在监测浅层组织中的生物分子方面具有不可替代的价值[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，其穿透深度和空间分辨率受到组织光散射的限制（<1毫米）[22]、[23]、[24]、[25]。光声（PA）成像技术通过检测激光产生的超声波克服了这一限制，其厘米级的组织穿透深度和亚毫米级的空间分辨率使其成为观察深层结构的理想选择[26]、[27]、[28]。虽然单独使用PA成像技术的灵敏度有限，限制了全身应用[29]，但将其与NIR荧光成像结合形成双模态方法可以产生强大的协同效应。这种组合结合了NIR荧光的高灵敏度和实时能力以及PA的深度穿透力和空间分辨率，从而显著提高了检测的准确性和可靠性[30]、[31]、[32]。

MB作为一种用于癌症治疗的诊断-治疗探针显示出巨大潜力，利用其固有的成像和治疗特性[33]、[34]。其高NIR荧光量子产率和优异的ROS生成能力使得荧光成像和PDT效果显著。由于MB的氧化（活性）状态和还原（非活性）状态在吸收和荧光特性上存在显著差异，它具有较低的背景信号特征，特别适合设计可激活的探针[37]、[38]。此外，某些MB衍生物利用光可断裂的键，在NIR激光照射下释放活性MB以启动局部PDT[39]。因此，MB具有独特的优势，包括用于诊断的强荧光、用于细胞毒性治疗的强ROS生成能力，以及用于整合癌症成像和治疗的可激活设计原则。关键的是，PDT作为一种治疗方式相比化疗或手术等传统治疗方法具有明显优势，包括最小侵入性、降低全身毒性、通过光靶向实现精确的空间控制，以及对耐药性的较低敏感性[40]、[41]、[42]、[43]。然而，TME中高浓度的GSH会通过其巯基功能团迅速消耗肿瘤细胞内的ROS，从而降低PDT的效果[44]、[45]、[46]、[47]。

在这项研究中，我们开发了一种新型的NIR荧光/PA双模态诊断和治疗探针MB-2O-MB，该探针可被TME中的高浓度GSH特异性激活（图1）。核心设计原理是通过一个对巯基敏感的二硫键将两个MB单元连接起来，从而诱导荧光自淬灭。当探针进入肿瘤区域时，高浓度的GSH会断裂二硫键，释放出自由的MB分子。这一激活过程实现了双重诊断功能：1）在550-750纳米波长下恢复NIR荧光，实现高对比度的肿瘤成像；2）利用MB在NIR-I窗口的强吸收能力，实现高分辨率的PA成像。在治疗方面，激活后的自由MB作为高效的光敏剂，在660纳米激光照射下生成ROS，从而实现PDT。更重要的是，二硫键的断裂过程同时消耗了肿瘤中的GSH[48]、[49]。这种双重机制——同时生成光敏剂并削弱细胞抗氧化防御——显著提高了ROS的积累效率，从而大幅增强了PDT的抗肿瘤效果[50]、[51]、[52]。与现有的GSH响应探针相比，MB-2O-MB由于其低分子量、快速响应和高MB含量，将诊断和治疗功能整合到了一个探针中。这使得能够精确诊断肿瘤区域，并通过消耗GSH产生协同效应，显著提高癌症治疗效果[53]、[54]、[55]、[56]、[57]。

材料

所有化学试剂均购自上海Aladdin生化技术有限公司。所有光谱分析均使用1:1 DMSO/PBS混合液进行。

MB-Cl的合成

如图1所示，将1.918克（6.0 mmol）的MB溶解在100毫升二氯甲烷中。然后将1.908克（18.0 mmol）的Na₂CO₃和4.176克（24.0 mmol）的Na₂S₂O₄溶解在60毫升去离子水中，加入反应混合物中。在氮气氛围下室温下搅拌，直到溶液变为黄色。

MB-2O-MB的GSH响应和光谱特性

成功合成了MB-2O-MB（见图1），并首次评估了其对GSH的光谱响应。探针本身在680纳米处没有显著吸收，但在与GSH孵育1小时后，该波长的吸收强度增加了17.75倍（图2a）。在620纳米激发下，690纳米处的荧光发射强度增加了710倍（图2b）。结果表明，MB-2O-MB可以与GSH反应并表现出明显的光谱变化。

结论

总之，我们成功开发了一种新型的NIR荧光和PA双模态成像探针MB-2O-MB。这种对巯基敏感的探针在暴露于生物巯基时会发生特定的还原反应，释放出荧光染料MB，随后在680纳米处产生NIR荧光和PA信号。由于其高灵敏度和对巯基的强抗干扰能力，MB-2O-MB能够有效区分正常细胞和癌细胞，实现双模态成像。

CRediT作者贡献声明

曾瑞峰：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。 苏晓燕：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，数据管理。 兰彩米：形式分析，数据管理。 李洪宇：方法学，概念构思。 易廷庄：方法学，形式分析。 张彤：验证，监督。 兰金帅：监督，项目管理。 丁月：验证，资源协调。 姜能：资源协调，实验研究。

伦理批准

该研究获得了上海中医药大学伦理委员会的批准（批准编号：PZSHUTCM2507240013），并遵循ARRIVE指南进行。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了广西科学基金“杰出青年学者计划”（资助编号：2022GXNSFFA035030）、上海领军人才计划（资助编号：2019100）、上海学术/技术研究领军人才计划（资助编号：22XD1423000）、上海教育发展基金会和上海市教育委员会支持的“曙光计划”（资助编号：20SG43）以及上海市科学技术委员会的项目（资助编号：20S21902500）的支持。